3个黑龙江烟区烟草花叶病毒分离物的全基因组序列测定与分析

姜瀚林，郭兆奎，刘永中，万秀清，刘文涛 ，李现道，李向东

1 山东农业大学，植物保护学院植物病毒学研究室，山东泰安岱宗大街61号 271018；

2 黑龙江省烟草科学研究所，黑龙江哈尔滨哈药路17号 150076；

3 山东临沂烟草有限公司，山东省临沂市兰山区北城新区智圣路3号 276003；

4 山东省烟草研究院，山东济南舜华东路13号 250098

烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的代表种，是危害烟草、番茄和马铃薯的主要病毒。TMV侵染烟草可引起花叶及疱斑等症状，严重影响烟叶产量及品质。TMV基因组为正义单链RNA，5′端有m7G5′pppG帽子结构，3′端有tRNA-like结构，基因组全长6395核苷酸（nt）左右［1-3］。

明确TMV分子株系对指导病毒早期检测及防治有重大意义。谢扬军等［4］对国内8个主要产烟省的TMV分离物进行株系划分，证明我国TMV株系划分存在地理隔离。杨恭等［5］测定了TMV中国U1株系分离物及弱毒番茄分离物的全基因组序列。邵碧英等［6］测定了福建TMV普通株系及两个弱毒突变体的全基因组序列。庞小静［7］等测定了TMV山西分离物的全基因组序列。目前还没有关于黑龙江TMV烟草分离物全基因组序列测定及分析的报道。本文测定了3个黑龙江烟草TMV分离物的全基因组序列，并与GenBank中26个TMV分离物进行了一致率、重组、选择压力和系统发育等分析，为黑龙江烟区TMV检测及抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

发病烟草样品采自黑龙江省哈尔滨市和牡丹江市，3个样品分别命名为HEB1、HEB2和MDJ。大肠杆菌DH5α由本实验室保存。植物总RNA提取试剂盒Transzol、DNA凝胶回收试剂盒等均购自北京全式金公司;TaqDNA聚合酶购自南京诺唯赞公司，M-MLV反转录酶、pMD18-T克隆载体、LATaqDNA聚合酶和末端转移酶购自TaKaRa公司; Super ScriptTMⅣ反转录酶购自Invitrogen公司。其他生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 扩增策略及引物合成

使 用DNAMAN（version7）对GenBank中 的TMV序列进行比对，选择保守片段设计引物，分两段进行全序列扩增。引物序列详见表1。

表1 TMV全基因组扩增引物Tab.1 Oligonucleotide primers used to amplify the complete genome of TMV

1.2.2 植物总RNA提取、RT-PCR扩增及5′RACE

利用Transzol试剂盒提取植物总RNA，M-MLV反转录酶进行反转录，分两段扩增5′端以外的TMV基因组片段。依照Elizabeth等［8］的5′ RACE扩增TMV 5′端基因组。

1.2.3 克隆及序列测定

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外灯下切取3498 bp和3470 bp处胶条。使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收PCR产物并连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞后，蓝白斑筛选挑取白色单菌落，PCR验证阳性后选取3个克隆送北京华大基因公司测序。

1.2.4 核苷酸序列一致率分析

使用DNASTAR软件包的Seqman对序列进行拼接，通过MegAlign与GenBank中26个TMV分离物（表2）序列进行比对，分析3个分离物全基因组在氨基酸和核苷酸水平与参比序列的一致率。

表2 本文分析用的29个TMV分离物序列号及来源Tab.2 Accession number, host and geographical origin of the 29 TMV isolates analyzed in the paper

续表2

1.2.6 系统发育分析

以ToMV queensland分离物为外组，选取GenBank中26个TMV分离物，通过MEGA7中 CLUSTAL W模块进行序列对比,以邻近法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统进化树，自展值设置为1000并去掉小于50%的分支。同时使用MEGA7计算组内距离和组间距离。

1.2.5 重组分析

将序列用 CLUSTAL X1.81软件进行比对，使用RDP（version4.95）软件包进行重组分析。通过 RDP、GENECONV、BOOTSCAN、MAXCHI、CHIMAERA、SISCAN 和 3Seq 七种算法分析。当四种以上算法支持重组，且P＜1.0×10-6时，该分离物可认定为存在重组。

1.2.7 选择压力分析

使用MEGA7中Pamilo-Bianchi-Li算法，分别计算各蛋白的dN/dS值，若dN/dS＞1，说明存在正选择；若dN/dS=1，说明存在中性选择；若dN/dS＜1,说明存在负选择。

2 结果与分析

2.1 分离物HEB1、HEB2和MDJ基因组结构

HEB1、HEB2和MDJ 3个分离物基因组RNA长度均为6395 nt（GenBank登录号分别为MH595919、MH595920和MH595921）。分离物HEB1基因组RNA A、C、G、U的含量为别为29.1%、19.0%、24.1%和27.7%，HEB2为29.2%、19.0% 、24.1%和27.8%，MDJ为29.1%、18.9%、24.1%和27.8%。

3个分离物基因组均包含4个开放阅读框（ORF）。ORF1起于69 nt，止于3419 nt，编码分子量为126 kDa的蛋白，终止密码子TAG可被通读至4919 nt形成ORF2，编码分子量183 kDa的通读蛋白，两种蛋白共同行使依赖于RNA的RNA聚合酶功能（RNAdependent RNA polymerase，RdRp）。ORF3起 于4903 nt，止于5709 nt，编码分子量30 kDa的移动蛋白（movement protein，MP）。ORF4起于5712 nt，止于6191 nt，编码分子量17.6 kDa的外壳蛋白（coat protein，CP）（图1）。

2.2 核苷酸和氨基酸一致率分析

在全基因组水平上（表3），HEB1分离物基因组与Beipiao分离物的核苷酸一致率最高，为98.9%，与petTW分离物一致率最低，为85.8%。其中，ORF1/2与Beipiao分离物一致率最高，为99.4%，与Ohio V分离物一致率最低，为86.2%；ORF3与HEB2分离物一致率最高，为98.0%，与petTW分离物一致率最低，为81.6%；ORF4与MDJ分离物一致率最高，为99.3%，与petTW分离物和Ohio V分离物最低，同为89.1% 。HEB2分离物基因组与Chuxiong1分离物的核苷酸一致率最高，为97.1%，与petTW分离物一致率最低，为85.4%。其中，ORF1/2、ORF3和ORF4均与Chuxiong1分离物一致率最高，分别为97.0%、96.8%和97.9%，ORF1/2与Ohio V分离物一致率最低，为86.0%，ORF3和ORF4则与petTW分离物一致率最低，分别为81.1%和88.4%。MDJ分离物基因组与Beipiao分离物的核苷酸一致率最高，为99.6%，与petTW分离物一致率最低，为85.8%。其中，ORF1/2、ORF3和ORF4均与Beipiao分离物一致率最高，分别为99.6%、99.4%和99.8%；ORF1/2与Ohio V分离物一致率最低，为86.2%，ORF3与petTW分离物一致率最低，为81.3%，ORF4与petTW分离物和Ohio V分离物最低，同为88.9%。

在氨基酸水平上（表4），HEB1分离物183 kDa和MP均与MDJ分离物的氨基酸一致率最高，分别为98.8%和99.6%，183 kDa与petTW分离物和Ohio V分离物氨基酸一致率最低，均为95.5%；MP与petTW分离物氨基酸一致率最低，为86.8%。HEB2分离物183 kDa和MP均与Chuxiong1分离物氨基酸一致率最高，分别为99.0%和97.5%；183 kDa与petTW分离物和Ohio V分离物一致率最低，均为95.7%，MP则与petTW分离物一致率最低，为85.5%。MDJ分离物183 kDa与Beipiao分离物和TMV152分离物一致率最高，为99.8%，与Ohio V一致率最低，为96.2%；MP与Xingren1、Shenyang、Yihan1、Hechi和Songtao1等5个 分 离物一致率最高，均为99.6%，与分离物petTW一致率最低，为87.2%。三个分离物CP的氨基酸序列与其他分离物CP的氨基酸一致率相同，除petTW、Yihan1、Zigui、Rakkyo和Ohio V五个分离物之外，其他分离物一致率均为100%；与分离物Ohio V一致率最低，为97.5%。

2.3 分离物HEB1、HEB2和MDJ基因组重组分析

使 用CLUSTAL W将HEB1、HEB2和MDJ与其他26个TMV分离物序列比对，利用RDP分析可能重组情况。结果表明，所用的7种软件都检测到HEB1存在重组事件（表5），且其P值远远小于＜1.0×10-6，说明其基因组存在明显重组。HEB1基因组4780 nt -5462 nt来自HEB2（minor parent），其它部分来自MDJ（major parent）（图2）。

图2 HEB1重组模式示意图Fig.2 Recombination pattern of HEB1

2.4 系统进化关系

系统进化分析结果表明，29个TMV分离物聚为3个组（图3）。I（U1）组最大，包括24个分离物，以U1分离物为代表。该组又可以分为2个亚组，其中包括本研究中的HEB1、MDJ两个分离物以及福建U1株系分离物（FujianU1）、TMV152等共13个中国分离物聚为一个亚组，说明中国大部分TMV基因组具有一定保守性。来自中国蚕豆、西德和美国的11个分离物形成第2亚组。第II组包括HEB2、云南chuxiong1和日本Rakkyo三个分离物，以Rakkyo分离物为代表。台湾petTW与美国Ohio V分离物聚为III（Ohio）组。三个组中都有中国分离物，说明中国TMV分离物具有更高的遗传多样性。

为验证分组的可信度，计算组内距离和组间距离（表6）。结果表明I（U1）组内遗传距离为0.009，II（Rakkyo）和III（Ohio）组内遗传距离较大，分别为0.021和0.022，但组间距离大于组内距离，证明该系统进化树可信。

图3 基于HEB1、HEB2、MDJ和其他26个TMV分离物构建系统进化树Fig.3 Phylogenetic analysis of HEB1, HEB2, MDJ and other 26 TMV isolates

表6 组内和组间遗传距离分析Tab.6 Genetic distances within and between groups

2.5 选择压力分析

126 kDa、54 kDa、MP和CP四个蛋白dN/dS值均小于1（表7），表明TMV各蛋白处于负选择（或称为纯化选择）。其中，126 kDa蛋白的dN/dS值最大，而54 kDa的dN/dS值最小，说明126 kDa受到的选择压最小而54 kDa受到的纯化选择压最大。

表7 TMV各蛋白选择压力分析Tab.7 Selection pressure analysis of TMV proteins

表3 HEB1、HEB2和MDJ与其他TMV分离物核苷酸的序列一致率Tab.3 Sequence identities between HEB1, HEB2 and MDJ with other TMV isolates at nucleotide level %

表4 HEB1、HEB2和MDJ与其他TMV分离物氨基酸的序列一致率Tab.4 Sequence identities between HEB1，HEB2 and MDJ with other TMV isolates at amino acid levels %

3 讨论

3.1 TMV株系划分及地理分布

以往的研究中TMV的株系划分主要依据生物学特性。谢联辉等［9］将福建烟草TMV划分为普通株系（TMV-C）、番茄株系（TMV-Tom）、黄色花叶株系（TMV-YM）和环斑株系（TMV-RS）4个株系，王劲波等［10］将山东烟区TMV划分为普通株系（TMVC）、坏死株系（TMVN）、黄化株系（TMVY）和环斑株系（TMVSR）4个株系。但TMV症状表型易受环境、寄主长势及侵染时间等条件影响［11］。近年来，TMV的鉴定和株系划分多依据核酸序列。Arguila等提出了划分十字花科烟草花叶病毒属病毒的标准：核苷酸序列一致率高于95%的为同一病毒，一致率85%～95%为密切相关的病毒。

Jakob等［12］对Ohio V株系进行全序列扩增并同其他Tobamovirus病毒比对4个ORF序列一致率，判定Ohio V与台湾矮天牛PetTW分离物属于同一株系。丁铭等［13］对云南的5个分离物扩增CP序列、秦西云［14］等对云南的38个分离物进行了CP序列扩增和分析，判定以上所有分离物均属U1株系。王莉爽等［15］对贵州的13个TMV烟草分离物进行CP扩增，发现云南分离物与贵州分离物CP序列一致率较高。刘天波等［16］根据地理相关性将TMV分为3个种群。将其系统进化树与图3比对，发现其3个种群基本对应I（U1）组的3个分支。刘金亮等［17］根据CP序列将TMV分为5个组。黄金光等［18］根据TMV的CP序列和症状特点将TMV分为2个株系。本文通过系统进化分析判断TMV分为3个组，其中分离物HEB1和MDJ属于U1株系，而且黑龙江烟区的U1株系与辽宁的Beipiao分离物聚类到一起，形成独立的一个分枝。HEB2属于Rakkyo株系，说明日本Rakkyo株系可能已经传播到了黑龙江。此前，该株系只在我国云南楚雄有发生。

3.2 TMV进化分析

选择压力分析表明TMV四个蛋白均处于负选择，说明寄主和环境等因素对TMV的选择压力很大，不利于蛋白变化，引起蛋白改变的突变体更容易被淘汰。与126 kDa蛋白和MP比较，CP面临的选择压力最大，这与蛋白氨基酸一致率的分析结果一致。在这4个蛋白中，54 kDa蛋白的dN/dS最小，说明该蛋白承受的选择压力更大，这可能与该蛋白是通过通读策略翻译产生的有关。

重组是病毒进化的重要途径之一，可改变病毒致病力［19］，扩大寄主范围［20～22］，有利于病毒适应当地环境。分离物HEB1存在重组信号，为MDJ与HEB2重组，说明Rakkyo株系可能与U1株系TMV分离物发生重组。

4 结论

本研究测定了黑龙江烟区3个TMV分离物的全基因组序列，进行了一致率、重组、系统进化和选择压分析，主要结论如下：

（1）HEB1、HEB2和MDJ的基因组全长均为6395核苷酸。HEB1和MDJ与辽宁分离物Beipiao一致率最高，分别为98.9%和99.6%；HEB2与云南分离物Chuxiong1一致率最高，为97.1%。

（2）HEB1是MDJ和HEB2的重组体。

（3）TMV根据全基因组序列分为3个组，其中HEB1和MDJ均属I（U1）组，HEB2属Ⅱ（Rakkyo）组。

（4）TMV的4个基因均处于负选择，其中衣壳蛋白基因的选择压力最大。