烟草赖百当二萜代谢调控机制研究进展

黄婷婷，王静，符云鹏

河南农业大学烟草学院/烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州市文化路95号 450002

烟草在代谢过程中可以生成多种萜类化合物。萜类化合物是由数个异戊二烯单位构成的，根据数目不同分为单萜、倍半萜、双萜、三萜、四萜、多萜等，其中三萜、四萜化合物为初生代谢产物，如甾醇、类胡萝卜素、赤霉素、脱落酸、油菜素内酯等，是烟草生长发育所不可缺少的；单萜、倍半萜、双萜则属于次生代谢物质，与烟草的抗性和品质密切相关[1,2]。大量研究表明，烟草中对烟叶香气品质贡献较大的萜类化合物主要是单萜、二萜和四萜，其中二萜类化合物如大环的西柏烷二萜（Cembranoid diterpenes）和双环的赖百当二萜（Labdanoid diterpenes）是烟草叶面分泌物中的重要物质，对卷烟的烟气特征和香型有着重要的影响[3-6]。西柏烷二萜普遍存在于普通栽培烟草如烤烟、白肋烟、香料烟等类型烟草中，据Wagner测定，在TI1608品种中西柏三烯二醇（CBTdiol）的含量约占叶面分泌物总量的60%、叶片干重的10%左右[5]；而赖百当二萜只存在于香料烟和少量的雪茄烟品种中[3,4,7-8]。不同类型烟草中西柏烷二萜和赖百当二萜类物质的含量及比例差别很大，这可能是导致不同类型烟草香气特征具有明显差异的主要原因之一[7-8]。国内外关于烟草西柏烷二萜代谢及其调控已有较多研究，并已有相关文献综述[4-6,8-10]，对烟草中赖百当二萜的研究相对较少[7-10]。烟草中赖百当二萜主要有顺-冷杉醇（Z-abienol）和赖百当烯二醇（Labdene-diol），顺-冷杉醇在烟叶调制及醇化过程中发生氧化、降解和转化，其降解产物主要有降龙涎香醚、龙涎香内酯等具有强烈的龙涎香香气的物质，对增加卷烟香气和吃味具有重要作用[9,12-14]。因此了解烟草赖百当二萜的合成与代谢途径及其调控机制，找到影响该类物质的重要基因及关键响应节点，为今后通过基因工程、代谢工程等手段进行烟草品种改良、香料物质生产等提供理论依据。

1 赖百当二萜的生物合成

1.1 赖百当二萜的生物合成途径

烟草中赖百当二萜类化合物主要有顺-冷杉醇和赖百当烯二醇，二者合成底物相同，均为香叶基香叶基二磷酸（Geranylgeranyl diphosphate, GGPP）[12,15-17]。而GGPP是由异戊烯基焦磷酸（Isopentenyl pyrophosphate, IPP）和其异构体二甲基丙烯基二磷酸（Dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP）为前体物形成的[12,17,18]。图1所示，赖百当二萜的合成首先是GGPP在NtCPS2基因编码的柯巴基焦磷酸合酶（Copalyl diphosphate synthases, CPSs）的催化下发生环化反应，形成8-羟基-柯巴基焦磷酸（8-α-hydroxycopalyl diphosphate, 8-OH-CPP）；NtABS基因编码的顺-冷杉醇环化酶以8-OH-CPP为底物合成顺-冷杉醇，而8-OH-CPP在赖百当二萜环化酶（Labdenediol cyclase）的催化下生成赖百当烯二醇，但该途径的关键基因到目前为止尚未报道[12]。

图1 赖百当二萜的生物合成途径Fig.1 Biosynthetic pathway of labdane diterpenes

1.2 赖百当二萜合成的品种差异性

Sallaud等[12]对美国农业部烟草种质资源库中不同类型烟草研究发现，在野生种林烟草中只检测到西柏烷类化合物西柏三烯二醇；栽培烟草晒黄烟品种Ambalema中只含有赖百当二萜类物质顺-冷杉醇，栽培烟草品种PI 486352中也只有赖百当二萜类物质顺-冷杉醇和赖百当烯二醇；PI 119210和香料烟Basma Drama、Izmir中既有西柏烷类又有赖百当二萜类物质，其中PI 119210中检测到西柏三烯二醇、顺-冷杉醇和赖百当烯二醇，Basma Drama品种中检测到较高含量的西柏三烯二醇和顺-冷杉醇，Izmir品种中检测到西柏三烯一醇、西柏三烯二醇和顺-冷杉醇。已有的许多报道表明烤烟、白肋烟、马里兰烟中一般不存在赖百当二萜类物质[4,7,8,12]，但李艳华[19]等人在高香气烤烟品种豫烟11号中检测到顺-冷杉醇和赖百当烯二醇，该品种具有特殊的香气。王国平[18]、常爱霞等[20]在特香型烤烟品种大白筋599、革新三号中检测到冷杉醇，这些特香型烤烟品种为寻找调控赖百当烯二醇和冷杉醇的关键基因提供了重要的材料。

2 合成赖百当二萜的关键基因

2.1 烟草顺-冷杉醇合成关键基因的发现

早在上世纪80年代就有烟草中冷杉醇受一个单基因Abl控制并有可能编码冷杉醇合成的报道[21]，随后Vontimitta等[22]将该基因定位于烟草A号染色体上。Falara等[23]将NtCPS2基因进行原核表达，该融合表达蛋白经脱磷酸化后采用GC-MS分析，结果表明NtCPS2催化形成了13（E）-labdene-8-ol-15-diphosphate，故推测NtCPS2参与顺-冷杉醇的生物合成。直到2012年，冷杉醇首次在裸子植物冷杉属香脂树中通过转录组测序克隆到该基因，并证明该基因编码的酶同时具有Ⅰ类或Ⅱ类功能活性域[24-27]。同年Sallaud等[12]从香料烟Basma Drama中成功克隆到了NtCPS2和NtABS两个基因，证实了顺-冷杉醇是由NtCPS2和NtABS依次催化合成，并在不含顺-冷杉醇的二倍体野生种林烟草中进行了转基因验证，进一步证明这两个基因共同编码冷杉醇的合成。体外酶试验等发现，NtCPS2通过捕获水催化GGPP形成8-OH-CPP，NtABS利用8-OH-CPP为底物合成顺-冷杉醇（图1）[12,18,24,28]。这两个基因的鉴定方法对赖百当烯二醇等其它赖百当二萜类物质合成基因的克隆和验证提供了借鉴思路。

2.2 顺-冷杉醇合成关键基因组织特异性

研究表明，烟草中合成顺-冷杉醇的基因NtCPS2和NtABS由腺毛特异性启动子驱动，只在腺毛中特异性表达[12,18,29,30]。Sallaud 等[12]从香料烟 Basma Drama中扩增了NtCPS2基因上游1400bp的启动子序列，连接到含有GUS基因的载体上，转化烟草后发现该段序列能够驱动GUS基因在腺毛的分泌细胞中特异性表达；同时采用定量RT-PCR方法，对NtCPS2和NtABS基因在腺毛和叶片中的表达量进行了分析，同时以合成西柏三烯二醇的腺毛特异性表达基因CYP71D16为对照，计算出NtCPS2和NtABS基因在腺毛和叶片中的表达比率分别为116.93和63.64；王国平等[18]研究表明，香料烟Samsun中NtCPS2和NtABS基因在腺毛中的表达量分别是去除腺毛叶片中表达量的800多倍、500多倍，烤烟红花大金元这两个基因在腺毛中的表达量分别是去除腺毛叶片中表达量的400多倍、700多倍。上述研究均说明NtCPS2和NtABS基因在腺毛中特异性表达。

2.3 顺-冷杉醇合成关键基因的多态性

Sallaud等[12]研究了不同类型烟草中NtCPS2和NtABS的差异，结果发现产生顺-冷杉醇和不产生顺-冷杉醇烟草品种的NtABS基因cDNA序列没有差异，但NtCPS2基因cDNA序列存在两种多态性，这两种多态性都位于NtCPS2基因第4个外显子的20bp内，一个是在第275位碱基位置出现一个8碱基插入序列（INDELCPS2），另一个是在292位碱基上出现了一个SNP 突变位点（SNPCPS2），即由G转变为T。这两种突变在同一品种中不共存，并且90%以上品种属于SNP 突变类型。INDELCPS2导致NtCPS2基因在插入位点下游3个碱基处提前出现终止密码子，而SNPCPS2导致在突变处产生一个终止密码子。这两种突变均造成肽链合成提前终止，编码的蛋白丢失了相应的活性位点，致使其丧失了原有功能。常爱霞等[20]研究了含顺-冷杉醇的烤烟品种大白筋599与不含顺-冷杉醇的烤烟品种G28、红花大金元等品种NtCPS2基因的第4个外显子序列之间的差异，发现大白筋599的NtCPS2基因第4个外显子是正常序列，而G28、红花大金元等品种中NtCPS2基因均在292位碱基处发生了SNP突变。王国平[18]针对该SNP 位点开发了两对鉴定冷杉醇有无的分子标记（1F/R1和8F/R1）用于种质鉴定和分子标记辅助选择育种。

此外，顺-冷杉醇的合成只是在转化林烟草中得到验证，并且只有在同时转化NtCPS2和NtABS时才会表达[12]。王国平[18]等以香料烟Samsun（可合成顺-冷杉醇品种）为阳性对照，测定栽培烟草红花大金元T0代转基因植株。结果显示转NtABS单基因的阳性植株、转NtCPS2单基因的阳性植株和同时转基因NtABS和NtCPS2的阳性植株，均没有检测到顺-冷杉醇的合成，分析原因可能是转基因植株中35S启动子活性不强导致基因表达水平较低，或者存在转基因沉默的问题；同时，对比烤烟红花大金元基因NtCPS2上游约1500bp序列与香料烟 Basma DramaNtCPS2启动子序列完全匹配，表明烤烟和香料烟中的NtCPS2极可能是同一个启动子。这对以后定向改良烤烟冷杉醇合成特性具有重要意义。

3 赖百当二萜的降解与应用

3.1 赖百当二萜与烟草抗病、抗虫性相关

有研究表明，赖百当二萜可能与植物抗虫、抗病性有关[9,31-35]。Seo等[35]将赖百当二萜类物质冷杉醇、硬尾醇分别以100μmol/L浓度施到烟草、番茄和拟南芥根部，能够诱导抗病基因的表达从而抑制枯萎病发生；将烟叶中分离的（11E,13E）-赖百当-11,13-二烯-8α,15-二醇（WAF-1）喷洒到烟草叶片上，增强了对烟草TMV侵染的抗性，且WAF-1主要是作为内源信号物质通过调节烟草对TMV侵染的防御反应而起作用的[36]。此外，Vontimitta等[21]以Beinhart1000与Hicks为亲本，获得118株双单倍体株系群体，构建了24个含200个标记位点的连锁图谱，并定位到了6个与黑胫病有关的QTL位点，其中位于4号连锁群上的黑胫病QTL位点与基因Abl处于同一个位置。William等[37]采用体外试验表明，顺-冷杉醇和有关二萜的浓度在0.01～100 mg/kg范围内可抑制烟草黑胫病菌菌丝的生长；但在观察导入合成顺-冷杉醇基因的材料中发现，顺-冷杉醇的积累能力与烟株的抗病性没有关系，在大田条件下顺-冷杉醇对烟草黑胫病的发病叶没有影响。因此，目前尚不能说明顺-冷杉醇合成基因与烟草黑胫病的抗性有关。

3.2 赖百当二萜的降解及其在卷烟加香中的应用

赖百当二萜主要存在于香料烟和部分雪茄烟中，主要成分是由叶片腺毛分泌的顺-冷杉醇、赖百当烯二醇和硬尾醇等化合物[4,7-9,14]。在烟叶调制和醇化过程中，绝大部分冷杉醇、硬尾醇和赖百当烯二醇发生氧化、降解，其降解产物主要是降龙涎香醚、龙涎香内酯、γ-双环同法尼醛和脱氢龙涎香内酯，这些化合物都具有强烈的龙涎香香气，对增加卷烟香吃味有着非常重要的作用[4,38,39]。这几种化合物有些已在烟草或烟气中分离鉴定，但也有的因为含量太低，尚未明确鉴定。值得一提的是，图2中的化合物都具有旋光异构体，图中的异构体具有相似的立体构型特点，且都具有强烈的杉木香和龙涎香香气，它们的对映异构体则截然不同，香味不明显，这说明立体构型在香味化学中具有重要作用[40]。此外，顺-冷杉醇作为琥珀样龙涎香的半合成前体物，因其优美的香气、良好的定香效果及对烟气质量的影响，被广泛应用于香料工业[9,12]。降龙涎醚是赖百当二萜降解产物中作用特别突出的一种香味物质，与烟草的特征香韵谐调和合，并可掩盖杂气，即使微量使用，也可改善烟草的香味品质，尤其适合混合型卷烟加香[13,15,40]。因降龙涎醚分子量小、挥发性强、阈值低，应用时多将降龙涎香二醇制备成碳酸酯或草酸酯等潜香物质加入到卷烟配方中，在卷烟燃吸过程中均匀释放降龙涎醚，使卷烟具有较明显的龙涎香香气[13,41-43]。

4 展望

烟叶的香气是限制卷烟质量提升的重要因素，特别是随着卷烟降焦减害的深入发展，卷烟的香气量和烟气浓度难以满足消费者的需要，对烟叶原料的质量提出了更高的要求。改良栽培、调制措施可以在一定程度上改善烟叶的香气质、提高烟叶的香气量，但通过生物技术手段培育新的具有特色香型风格的烤烟新品种，为中式卷烟提供香韵丰富、香气量充足的特色烟叶原料也是一个重要的途径。

图2 顺-冷杉醇的降解及产物转化Fig.2 Degradation and product transformation of Z-abienol

香料烟、部分雪茄烟品种及大白筋599、豫烟11号、革新三号等具有特殊香气的烤烟品种含有顺-冷杉醇等赖百当二萜类物质[3-5,7,8,12,19,20]。前人研究已经证明了香料烟中顺-冷杉醇的合成关键基因是NtCPS2和NtABS[12,18,20]，李国平将这两个基因克隆且导入到烤烟中，结果转NtCPS2和NtABS基因烟株没有检测到顺-冷杉醇[18]。常爱霞等[20]研究表明，顺-冷杉醇是大白筋599关键致香物质，并且明确NtCPS2基因第292 位碱基由G突变为T是导致生产主栽烤烟品种不含冷杉醇的主要原因。因此，应对含有顺-冷杉醇并具有特殊香气的这类烤烟品种资源的香气形成机理进行深入解析，进一步研究香料烟顺-冷杉醇合成及代谢途径中关键基因NtCPS2和NtABS的结构、功能及其调控机制等，为今后通过分子育种手段快速培育含有顺-冷杉醇的、具有特色香气的烟草新品种具有重要意义。

研究表明，赖百当二萜的降解产物降龙涎香醚、龙涎香内酯具有强烈的龙涎香香气，常应用于卷烟工业的加香加料，微量使用即可掩盖杂气，可改善卷烟的香味品质[4,12,13,39]。由化学方法生产的的降龙涎香醚因可能存在杂质而在香气特征和安全性方面均不令人满意[44]。因此，研究赖百当二萜的提取与纯化方法，可以利用香料烟等含有赖百当二萜的低次烟叶提取赖百当浸膏，用于卷烟加香，以改善卷烟的香吃味。