沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒（CMV）的转基因烟草

芮鹏环，宋培培,2，蒋磊，江彤

1 安徽农业大学植物保护学院，合肥 230036；

2 山东省平度市农业局，山东 平度 266700

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员[1]，其基因组含3个RNA组分，分别为RNA1、RNA2和RNA3， RNA2 3'端ORF编码2b蛋白，已证明是病毒基因沉默的抑制子[2]。植物通过基因沉默机制抑制病毒在寄主内的积累，抵抗病毒的侵染。为了打破寄主的沉默免疫系统，多数病毒自身可以编码RNA沉默抑制子，抑制寄主的沉默防卫反应，导致植物发病。基于转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）原 理[3-4]，沉默病毒的沉默抑制子，有望提高寄主的抗病性。

目前，利用dsRNA技术沉默病毒的沉默抑制子已见报道。将马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）Hc-Pro基因部分片段顺次正反向插入植物表达载体，构建的RNAi载体具有发夹结构，利用农杆菌介导法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85，获得T1代转基因高抗PVY的烟草株系[5]。构建芜菁花叶病毒（Turnip mosaic viruses，TuMV）HC-Pro基因部分片断反向重复植物表达载体，农杆菌介导法转化拟南芥，继代筛选获得T3代高抗TuMV的转基因纯合拟南芥株系[6]。水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）NS2基因和NS3基因编码的蛋白均具有沉默抑制子功能，将串联的NS2+NS3分别正反向插入含有1个intron的RNAi载体，转化水稻获得31株T0代转基因水稻植株，接种RSV发现，转基因水稻发病时间推迟，病毒积累量下降[7]。目前，利用dsRNA技术沉默CMV沉默抑制子2b基因，获得转基因抗病毒烟草植株尚未见报道。本研究拟构建CMV2b基因反向重复表达载体，转化普通烟草品种云烟85，以获得能够稳定遗传的抗CMV转基因烟草株系，为利用基因工程技术防治CMV提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料采集安徽省芜湖县烟区表现出CMV症状的烟草，鉴定后摩擦普通烟草（N.tabacum）作为CMV毒源，烤烟品种云烟85由云南省烟草科学研究所刘勇研究员惠赠，含CMV2b基因的重组载体（pBIN-2b（r, i））由宋培培构建[8]，本实验室保存。

1.1.2 试剂

CMV 抗血清检测试剂盒购自上海贝优生物技术公司，TaqDNA聚合酶购自上海生工生物工程公司，T4连接酶和克隆载体pMD18-T购自大连宝生物（TaKaRa）公司，DNA消化酶和限制性内切酶购自美国Promega公司，RNA抽提试剂TRIzol购自Invitrogen生物技术有限公司；质粒抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，反转录试剂盒购自北京诺博莱德科技有限公司，抗生素购自美国Sigma公司；其他药品均购自国药集团化学试剂公司。

1.2 试验方法

1.2.1 pBIN-2b（r, i） T0代转基因烟草的获得及PCR检测

反向重复重组载体pBIN-2b（r, i） 冻融法转化农杆菌GV3101，筛选阳性克隆。将云烟85无菌叶片切成0.8×0.8 cm2大小叶盘，置于MS固体培养基上预培养，农杆菌浸润侵染新鲜叶盘组织，侵染过的叶盘在分化培养产生愈伤组织，长出抗性芽后转入生根培养基生长，最后移栽盆钵，获得转基因云烟85植株。提取转基因烟株总RNA，RT-PCR法检测靶标基因（2b-F: 5'-ATGGAATTGAACGAAGGCGC-3’, 2b-R:5'-T-CAGAACGACCCTTCCG-3’）。

1.2.2 T0代转基因烟草的抗病性鉴定

称取CMV感病烟草叶片，按1：10重量体积比加入0.02 mol/L pH 7.2的PBS缓冲液，研磨后作为接种毒源。分别选取5株抗病和感病转基因烟株，以5株非转基因烟株作为对照，机械摩擦法接种CMV，15 d后记录发病症状表型，三抗夹心ELISA（Tas-ELISA）测定接种烟株的病毒增殖量[9]。

1.2.3 T1代转基因烟草的抗病性鉴定

云烟85T0代抗病烟株留种，播种扩繁T1代烟株，CMV摩擦接种7～8叶期T1代烟株，15 d后观察烟株发病症状，记录抗、感病烟株表型，统计各表型数量。再提取部分抗、感病T1代烟株的总RNA，选择烟草Actin蛋白作为内参基因（Nt-actin-F: 5’-TG GCTCTTGACTACGAGCAGGAGCTT-3’, Nt-actin-R:5’-ACCACTGAGCAC-AATGTTACCGTAGAGGT-3’），采用Real-time PCR方法，SYBR Green 1染料检测转基因云烟85烟株CMV2b基因（2b-RT-F:5’-CGTCGAACTCCAACTGGC-TCGT-3’, 2b-RT-R:5’GAATGGTAGGAAGCGGAACAGCC-3’）的RNA积累水平。

2 结果与分析

2.1 叶盘法转化云烟85

冻融法将pBIN-2b（r, i）导入农杆菌GV3101，叶盘法转化云烟85，卡那霉素抗性筛选，共获得112株T0代再生烟草植株（图1）。

图1 叶盘法转化烟草Fig.1 Tobacco plants transformed via leaf disc

2.2 T0代转基因烟草阳性植株的PCR检测

CTAB法提取112株T0代转基因烟株DNA，PCR扩增发现，从全部T0代转基因烟株中均能检测出大小为530 bp的特异性条带，转基因烟株阳性率达100%。

图2 转基因烟草植株的PCR检测Fig.2 PCR detection of the transgenic tobacco plants

2.3 T0代转基因烟草的抗病性鉴定

将112株T0代转基因烟草依次编号，分别接种等量CMV，15 d后观察症状。结果发现，46个T0代转基因烟株不产生任何症状，表现为抗病，占41.1%；其他66个转基因烟株产生不同程度的花叶症状，表现为感病，占58.9%；非转基因烟草接种CMV 15 d后，全部出现严重的花叶症状（图3）。

图3 T0代转基因烟草植株接种CMV的症状表现Fig.3 Symptoms of transgenic T0 transgenic tobacco plants inoculated with CMV

选取T0代转基因抗病烟株和感病烟株各5株，Tas-ELISA检测烟株样本中的病毒含量。结果表明，5个抗病烟株的OD405平均值为0.117，显著低于5个感病烟株的OD405平均值0.391。转基因感病烟株的OD405和接种CMV的非转基因烟株（CK+）OD405相近，转基因抗病烟株的OD405接近于未接种的非转基因烟株OD405（表1），且转基因抗病烟株的OD405平均值显著低于转基因感病烟株的OD405。表明转化反向重复的2b基因确实可以提高转基因烟株对CMV的抗性。

表1 T0代转基因烟草植株接种CMV后的Tas-ELISA检测（OD405）Tab.1 Tas-ELISA detection of transgenic T0 tobacco plants inoculated with CMV （OD405）

2.4 T1代转基因烟草的抗病性鉴定

46株T0代转基因抗病烟株全部留种，随机选选择10个株系播种，每个株系移栽30棵苗，7～8叶期接种CMV，15 d后观察症状。统计结果发现，其中3个T1代烟株抗病株率达100%，7个T1代转基因烟株发生了不同比例的抗感分离，抗病株率为46.7%～80%。非转基因烟株接种CMV的发病率达100%（表2）。

表2 T1代转基因烟草对CMV的抗性鉴定Tab.2 Resistance identification of transgenic T1 tobacco plants to CMV

续表2

Real-time PCR检测CMV2b基因RNA在T1代转基因烟株的积累水平。结果发现，接种CMV后，表现为抗病的转基因烟株和表现为感病的转基因烟株中，CMV2b基因RNA的积累水平差异非常显著。转基因抗病烟株中CMV2b基因RNA的积累极低，而转基因感病烟株中检测到的CMV2b基因RNA积累水平很高。不接种CMV的转基因烟株和非转基因烟株均检测不到CMV2b基因RNA的积累（图4）。结果表明，T1代转基因烟株的抗病性确实是由RNA介导的。

图4 转基因烟株中CMV 2b基因RNA积累水平的Real-time PCR检测Fig.4 Real-time PCR detection of CMV 2b RNA accumulation level of transgenic tobacco plants

3 讨论

dsRNA诱导的RNA沉默在抗病毒转基因工程中广泛应用，特别是构建含有反向重复序列的载体转化植物，很容易高效转录获得dsRNA。Smith等[10]在反向重复序列之间插入一段内含子（intron），转录后形成dsRNA诱发基因沉默的效率将近100%。朱俊华等[11]发现诱发RNA介导抗性的最短有效基因片段介于202～417 bp之间。因此，本研究也借鉴了这种构建策略，克隆了长度为300～310 bp的2b基因正反向片段，在大豆内含子的两侧分别插入2b基因正反向片段，转化烟草获得高抗CMV的转基因烟株，表明该构建策略具有较好的沉默效果。

Tas-ELISA和Real-time PCR检测结果表明，CMV侵染转基因抗病烟株，病毒在烟株体内的积累量及病毒RNA转录水平均极低，表明构建的表达载体可以高效沉默CMV2b基因，抵御CMV的侵染。T1代转基因烟株的抗病性鉴定发现，部分烟草转化株系发生了不同程度的抗感分离，抗感比率符合3:1，推测可能是单拷贝株系，而抗性未见分离的，推测可能是多拷贝株系。抗感分离原因很复杂，可能与靶基因反向重复片段的长度和位置的选择有关。另外，外源基因在受体基因组中的插入方式、转基因的甲基化状况等也对外源基因的表达效率有影响[14]。

转基因烟草抗CMV，一般是将CMVcp基因、Rep基因或CMV反义2b基因转入烟草。本研究是将CMV2b基因反向重复序列插入内含子（intron）两侧，构建表达载体转化烟草，这种重组载体在转录时可以剪切掉intron，构建的2b（i, r）双臂结构更为紧凑，不易遭受核酶的攻击，稳定性强；其次，intron剪切的过程不仅有利于互补臂的形成，还有利于转录水平的提高[12-14]。另外，这种构建策略还可以避免病毒异源重组带来的生态安全性问题。本研究已得到了T1代转基因抗CMV株系，将分析转基因抗病性遗传规律，继代筛选T2代、T3代抗病株系，直到获得高抗CMV的单拷贝纯合株系。