桑叶多酚氧化酶活性研究
2019-03-11袁娅利胡玥婵郭丽彬田国政
袁娅利 胡玥婵 郭丽彬 柳 娜 田国政
（湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000）
自然界中，大多数植物经常会发生褐变，引起植物褐变的原因是多酚氧化酶（PolyphenolOxidase,PPO）与底物接触发生氧化还原反应，在有氧的条件下催化酚类物质形成醌类物质，从而生成黑色素，引起植物褐变，在食品行业里PPO易导致食品产品质量恶化。1894年Betrand首次研究了PPO，发现它是一种酶蛋白。1937年Kubowitz在Warburg实验室中第1次分离出PPO[1、2]。研究发现，PPO不仅对植物的褐变产生影响，还会影响植物的抗病性，参与植物的次生代谢，产生毒性物质杀死病原菌，PPO活性高会加强嫁接伤口处呼吸作用，加速伤口木质化，从而降低成活率[3]，PPO有防御昆虫[4]的功能。PPO的作用有利有弊。
桑叶是桑科植物桑（Morus.aLba.L.）的叶，约占桑树地上部产量的64%，不仅用作养蚕饲料，且为药食同源类植物[5]，富含有生物碱、黄酮和多糖类化合物以及多种酶类物质，对糖尿病、高血糖和高血压等疾病的预防和治疗疗效显著[6]。目前，对桑叶PPO的研究较少，对桑叶PPO活性[7]、桑叶PPO引起植物褐变的机理[8]、桑叶PPO的分离提纯[9]等研究有报道，但有很大的局限性。通过对恩施地区桑叶PPO的深入研究有利于桑叶的深度开发，充分利用桑叶PPO的性质，应用到农业、食品等行业中，提高农业产品的经济价值，降低因植物褐变引起的损失。
1 材料与方法
1.1 主要材料与设备
试验材料：幼嫩桑叶采摘于湖北民族学院综合实验楼后山。
试验仪器：AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司上海）、UV-2550紫外可见光分光光度计（尤尼柯仪器有限公司上海）、CR21高速冷冻离心机 日本日立公司）、Seven Easy pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司上海）、-80℃超低温冰箱（日本日立公司）。
1.2 方法
1.2.1 原料预处理。取幼嫩的新鲜桑叶，贮存于-80℃超低温冰箱。取1g桑叶，加入2g二氧化硅及5mL 0.01 moL/L磷酸缓冲液（pH值6）冰浴研磨。收集研磨液定容至50mL在4℃下12000 r/min离心30 min，上清液4℃保存备用。
1.2.2 桑叶PPO活性测定方法。在3.9mL磷酸缓冲溶液（pH值7.0）中，加入1.0mL 0.02moL/L焦性没食子酸溶液及0.1mLPPO粗酶提取液，混匀作为反应体系。以0.1mL磷酸缓冲液（pH值7.0）代替粗酶提取液的溶液加入反应体系作为空白对照，在420nm波长下吸光度值A[10]。A值每1min内变化0.01为1个酶活力单位（U）。则比酶活力计算公式如下：
比酶活力=U/V=100A/V
式中：U=总酶活力，V=粗酶提取液体积，A=吸光度值变化。
1.2.3 pH值影响桑叶PPO活性的测定方法。在3.9mL磷酸缓冲溶液（pH 值 5.0，6.0，6.5，7.0，7.2，7.5，8.0，9.0）中，加入1.0mL 0.02moL/L焦性没食子酸溶液及0.1mL PPO粗酶提取液，混匀作为反应体系，溶液置于室温下反应5min后测定酶的残留活性。
1.2.4 pH值对桑叶PPO活性稳定性测试。在3.9mL PB溶液（pH 值 5.0，6.0，6.5，7.0，7.2，7.5，8.0）中，加入 0.1mL PPO粗酶提取液，混匀作为反应体系，将溶液置于4℃冷藏48h后加入1.0mL 0.02moL/L焦性没食子酸溶液，测定酶的残留活性。
1.2.5 温度影响桑叶PPO活性的试验方法。在3.9mL pH值7.0的PB溶液中，加入1.0mL 0.02moL/L的焦性没食子酸溶液和0.1mL的桑叶PPO酶液，混匀后分别在20、30、40、50、60、70℃下反应5min，在420nm下测定酶的残留活性，前6min每1min测1次，6min后每2min测1次，直至反应稳定。
1.2.6 温度对桑叶PPO活性稳定性测试。将定量的酶液分别在 20、30、40、50、60、70℃的水浴中加热 10min。后在 3.9mLpH值7.0的PB溶液中，加入1.0mL 0.02moL/L的焦性没食子酸溶液，分别在20～70℃水浴中加热的桑叶PPO酶液0.1mL，混匀后在420nm下测定酶的残留活性，前6min每1min测1次，6min后每2min测1次，直至反应稳定。
1.2.7 激活剂、抑制剂影响桑叶PPO活性的试验方法。在3.9mLpH值7.0的PB溶液中，加入1.0mL 0.02moL/L的焦性没食子酸溶液、0.1mL的桑叶PPO酶液和1mL不同浓度的试剂，混匀后在室温下测定酶活性。具体试验方案见表1。
表1 不同激活剂、抑制剂对桑叶PPO活性的影响
1.2.8 底物浓度影响桑叶PPO活性的试验方法。在3.9mLpH值7.0的PB溶液中，加入0.1mL的桑叶PPO酶液和1.0mL不同浓度（0.006moL/L、0.008moL/L、0.01moL/L、0.02moL/L、0.04moL/L、0.06moL/L、0.08moL/L）的焦性没食子酸溶液，混匀后在室温下测定酶活性。
2 结果与分析
2.1 pH值对桑叶PPO活性的影响
如图1可知，桑叶PPO的最适pH值为6.0，当pH值5.0～6.0时，随着pH值的升高桑叶的PPO活性上升，上升幅度达到了66%；当pH值6.0～9.0时，随着pH值的上升桑叶PPO活性下降，至pH值9.0时，酶活性降至0.049U，降低幅度达到了88%。
图1 pH值对桑叶PPO活性的影响
2.2 温度对桑叶PPO活性的影响
如图2可知，桑叶PPO的最适温度为40℃，当20～40℃时，随着温度的升高桑叶的PPO活性上升，上升幅度达到了53%；当40～70℃时，桑叶PPO活性慢慢下降，下降了92%，温度为70℃时酶活性降至0.019U。故最适温度为40℃。
图2 温度对桑叶PPO活性的影响
2.3 桑叶PPO活性的稳定性
2.3.1 温度对桑叶PPO活性的稳定性测试。由图3可得，为保证在最短的时间内最大限度地抑制桑叶中酶的活性，以减少高温对营养活性PPO的活性保留率随着温度的升高而逐渐下降，其在20℃的条件下处理10 min后稳定性最强。温度分别为30、40、50、60、70℃时，可以有效抑制PPO活性。另外，70℃下桑叶的PPO的活性损失非常严重，几乎无保留。
图3 温度对桑叶PPO活性的稳定性测试
2.3.2 pH值对桑叶PPO活性的稳定性测试。如图4可知，桑叶PPO的最适pH值为6.0，当pH值5.0～7.0时，桑叶PPO活性随着pH值得升高而升高，呈现一个上升趋势，上升了20%；当pH值7.0～8.0时，桑叶PPO活性慢慢下降，下降了55%，pH值为8.0时酶活性降至0.0145U。
图4 pH值对桑叶PPO活性的稳定性测试
2.4 抑制剂对桑叶PPO活性的影响
2.4.1 抗坏血酸对桑叶PPO活性的影响。由图5可知，抗坏血酸对桑叶PPO抑制作用明显，当抗坏血酸的浓度在0.2～0.6mmoL/L范围内，随着抑制剂浓度的增加，酶的活性降低，抗坏血酸的浓度从0.6mmoL/L对桑叶PPO抑制作用开始缓慢，抗坏血酸的浓度在0.6mmoL/L是抑制率达到了86%。
图5 抗坏血酸对桑叶PPO活性的影响
2.4.2 柠檬酸、亚硫酸钠对桑叶PPO活性的影响。由图6可知，柠檬酸、亚硫酸钠对桑叶PPO都有一定的抑制作用，亚硫酸钠的抑制作用较柠檬酸明显，当亚硫酸钠和柠檬酸的浓度在0.01～0.1mmoL/L范围内，随着抑制剂浓度的增加，酶的活性降低较快，亚硫酸钠的浓度在0.1mmol/L时，抑制率达到87%，柠檬酸的浓度在0.1mmoL/L时，抑制率达到80%。当抑制剂浓度超过0.1mmoL/L以后，抑制作用变缓。
图6 柠檬酸、亚硫酸钠对桑叶PPO活性的影响
2.5 激活剂对桑叶PPO活性的影响
2.5.1 蔗糖、硼酸和硝酸铝对桑叶PPO活性的影响。由图7可知，蔗糖、硼酸和硝酸铝对桑叶PPO都有一定的激活作用，蔗糖的激活作用较硼酸和硝酸铝明显，当三者的浓度在0.01～0.1mmoL/L范围内，随着激活剂浓度的增加，酶的活性增加较快，硼酸的浓度在0.1mmoL/L时激活率达到88%，蔗糖的浓度在0.1mmoL/L时激活率达到75%，硝酸铝的浓度在0.1mmoL/L时激活率达到73%。当激活浓度超过0.1mmoL/L以后，激活作用变缓。
图7 蔗糖、硼酸和硝酸铝对桑叶PPO活性的影响
图8 底物浓度对桑叶PPO的影响
2.6 底物浓度对桑叶PPO活性的影响
由图8可知，从0.006～0.02moL/L时，桑叶PPO活性随着浓度上升而之间上升，呈现一个正比的趋势，上升了78%；从0.02～0.08moL/L时，桑叶PPO活性随着浓度上升而逐渐下降，下降了50%。所以最适的底物浓度为0.02moL/L的焦性没食子酸。
3 结论
通过对桑叶多酚氧化酶活性的研究发现，不同条件下对桑叶PPO活性的影响不同，PPO活性的最适温度为40℃，当温度升高至70℃处理2min能明显抑制酶的活性，可把70℃作为控制发生酶促褐变的关键因素和温控指标；pH值对桑叶PPO活性的影响比较明显，通过调节反应体系pH值可抑制桑叶酶促褐变的发生，其酶活性最适的pH值为6.0，升高或降低pH均降低酶的活性；最适底物浓度为0.02moL/L的焦性没食子酸；在桑叶PPO活性的稳定性测试中，当pH值＜6.5、pH值＞7.2时，桑叶PPO的活性明显受到抑制；在对桑叶PPO活性的稳定性测试中，短时间高温（70℃）处理明显地抑制桑叶PPO的活性；进一步研究表明，蔗糖、硫酸铝和硼酸溶液对桑叶PPO活性有一定激活作用，硼酸的浓度在0.1mmoL/L时激活率达到88%，蔗糖的浓度在0.1mmoL/L时激活率达到75%，硝酸铝的浓度在0.1mmoL/L时激活率达到73%；抗坏血酸、柠檬酸、亚硫酸钠对桑叶PPO活性有一定抑制作用，亚硫酸钠的浓度在0.1mmoL/L时抑制率达到87%，柠檬酸的浓度在0.1mmoL/L时抑制率达到80%，抗坏血酸的浓度在0.6mmoL/L是抑制率达到了86%。抑制剂和激活剂有明显影响酶的活性，且存有明显的剂量效应。本研究为桑叶的开发以及桑叶PPO的利用提供了依据。
