骨痹通方对骨关节炎大鼠基质金属蛋白酶-3和Ⅱ型胶原酶的影响

杜梦梦 ，鄢泽然 ，陈颖颖 ，周 丽 ，陶庆文 ★

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院 中医风湿病科，中日友好医院 免疫炎性疾病北京市重点实验室，北京 100029）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是由多种因素导致的以软骨下骨破坏、关节软骨变性、滑膜炎和关节边缘骨赘形成为特征的慢性关节病变。据统计我国每年骨关节炎发病率约8.1%，随着年龄增长，发病率也逐年上升[1]。骨关节炎常伴有关节肿胀、疼痛、僵硬、活动受限等症状。中药在治疗骨关节炎上有着很大的优势，前期研究[2]发现骨痹通方改善膝骨关节炎患者关节疼痛、僵硬及活动困难程度等方面疗效显著。体外细胞实验也证实骨痹通方可以抑制Wnt/β-catenin信号通路中Wnt5a、β-catenin的表达从而达到保护关节软骨，抑制软骨细胞凋亡的作用[3]。本实验通过观察骨痹通方调控Wnt/β-catenin信号通路影响大鼠膝骨关节炎基质金属蛋白酶-3（matrix met alloproteinase-3，MMP-3）、Ⅱ型胶原酶（type Ⅱ collagenase，COL-Ⅱ）的表达，进一步探索骨痹通方保护关节软骨的机制及具体作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选用6周龄无特殊病原体级 （SPF级）雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠 35 只，体重 220～250g，中国药品生物制品检定所提供，动物许可证号：SCXK（京）2014-001，在中日友好临床研究所清洁级动物室喂养。

主要试剂有逆转录试剂盒（批号：A3500），美国 Promega公司生产；Power SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒（批号：QPK-201），日本 TOYOBO公司生产；引物合成由广州复能Genecopoeia合成；Wnt5a（批号：ab174963）、β-catenin（批号：ab32572）、COL-Ⅱ （批号：ab34712）、MMP-3 （批号：ab53015）、β-actin （批号：ab8227）， 均由英国abcam公司生产；二抗（批号：ab6721），英国abcam公司生产。

盐酸氨基葡萄糖胶囊，北京康必得药业有限公司生产（批号：05170513）。

仪器有美国MJResearch基因扩增仪 （TTC-220）；Applied Biosystems PCR 仪（ABI7500）；BIORAD 电泳仪 （042BR03674）；BIO-RAD 酶标仪（721BR16681）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与造模

雄性SD大鼠35只随机分为正常组、假手术组、模型组、盐酸氨基葡萄糖组和骨痹通组，每组7只。空白组不干预，假手术组仅暴露膝关节不切断韧带，其余组均Hulth法造模。造模方法如下：将大鼠用10%水合氯醛麻醉后仰卧于手术台上，无菌条件下取膝关节内侧纵切口长约2cm，显露膝关节，切断前后交叉韧带，取出内侧半月板，然后双层缝合伤口。术后予青霉素10万IU/只腹腔注射1周，预防感染。

1.2.2 药物制备

骨痹通方药物组成：骨碎补20g、补骨脂15g、淫羊藿 15g、杜仲 30g、烫狗脊 30g、青风藤 30g、鸡血藤30g、土贝母20g。均由中日友好医院中药房提供，由中日友好医院制剂室进行药物浓缩制备，使终浓度达到含生药4g/ml。

1.2.3 药物干预方法

正常组、假手术组和模型组给予3ml/只/d生理盐水灌胃，盐酸氨基葡萄糖组予0.065g/kg/d灌胃，骨痹通组用药量按照人与大鼠体表面积等效剂量比值计算，予17g/kg/d灌胃。共灌胃6周。

1.2.4 取材

灌胃治疗完成后，大鼠10%水合氯醛4ml/kg麻醉下，取手术侧膝关节，低温环境下提取膝关节软骨，放置-80℃保存备用。

1.2.5 检测方法与指标

表1 相关引物序列

表2 Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的基因相对表达量

以每组5只样本进行检测。用软骨RNA提取试剂盒提取软骨中的RNA，用逆转录试剂盒进行逆转录，用 Real-time PCR仪检测Wnt5a、βcatenin、MMP-3、COL-Ⅱ的相对基因表达量，相关引物序列详见表1。

用RipA裂解液裂解软骨组织蛋白，BCA法检测蛋白浓度，Western blot法检测 Wnt5a、βcatenin、MMP-3、COL-Ⅱ的蛋白表达量。

1.3 统计学方法

应用SPSS22.0软件进行统计学分析。满足正态分布的数据，采用单因素ANOVA分析，2组间比较采用LSD法，对于分布非正态的数据，采用非参数检验。

图1 Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的相对蛋白表达量

2 结果

2.1 Real-time PCR结果

根据Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达结果，骨痹通方与正常组、模型组、盐酸氨基葡糖组差异均有统计学意义（P＜0.05）。正常组与模型组差异有统计学意义（P＜0.05）。Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的相对基因表达量详见表2。骨痹通方与正常组、模型组、盐酸氨基葡糖组相比可以明显抑制 Wnt5a、β-catenin、MMP-3 的基因表达（P＜0.05），促进 COL-Ⅱ的基因表达（P＜0.05）。模型组与正常组相比，可以显著促进Wnt5a、βcatenin、MMP-3 的基因表达（P＜0.05），减少 COL-Ⅱ的基因表达（P＜0.05）。

2.2 Western blot结果

根据Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达（图1）可知，骨痹通方与模型组、盐酸氨基葡萄糖组相比，可以显著抑制 Wnt5a、β-catenin、MMP-3的蛋白表达（P＜0.05），骨痹通组与正常组、模型组、盐酸氨基葡萄糖组相比可以明显促进COL-Ⅱ的蛋白表达（P＜0.05）。模型组、盐酸氨基葡萄糖组与正常组相比，可以明显促进 Wnt5a、βcatenin、MMP-3 的蛋白表达（P＜0.05），抑制 COL-Ⅱ的蛋白表达（P＜0.05）。 Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的相对蛋白表达量详见图1。

3 讨论

3.1 中医认识“骨痹”及中药干预Wnt/β-catenin信号通路的相关研究

骨关节炎在中医属“骨痹”范畴，痹病之名首见于《黄帝内经》，《素问·痹论》云：“风、寒、湿三气杂至，合而为痹。”《素问·痹论》提出“五脏皆有合，病久而不去者，内舍于其合也。故骨痹不已，复感于邪，内舍于肾”。可见，骨痹的发生与感受风寒湿邪有关，骨痹日久，累及于肾，肾气不足则骨痹愈重，因此治疗骨痹，当从补肾扶正论治，正气足则可驱除外邪，疾病自愈。詹宏刚等人[4]用独活寄生汤治疗肾虚寒湿证膝骨关节炎，发现活寄生汤可以抑制 Wnt/β-catenin 信号通路中 Wnt5a、βcatenin、BMP-2mRNA表达，起到缓解骨关节炎疼痛的作用。肖志峰等人[5]通过模拟骨关节炎滑膜细胞实验，发现补肾活血方能够抑制β-catenin的表达，减少致炎因子MMP-7、COMP等的含量，保护关节滑膜，减轻骨关节损伤。这些研究从多方面证实补肾中药可以显著抑制Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白的表达，减少炎症因子释放，从而发挥对骨关节的保护作用。

3.2 Wnt/β-catenin信号通路及其对软骨细胞凋亡的影响

研究显示[6，7]，Wnt/β-catenin 信号通路是参与骨关节炎发生和发展的重要通路，影响骨关节炎软骨细胞分化、增殖和凋亡。骨关节炎患者体内Wnt/β-catenin 信号通路呈激活状态[8～10]，这主要是由于细胞外Wnt信号分子与细胞膜上特异性受体蛋白（frizzled）及辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP5/6）结合后形成Fz-LRP5/6复合物结合散乱蛋白（Dvl）促进LRP5/6磷酸化，促使轴蛋白（Axin）聚集到细胞膜抑制β-catenin磷酸化，稳定的β-catenin移位到细胞核，联合T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）和聚集共激活剂，促使RNA转录和延伸。相反，当Wnt-Fz-LRP5/6受体复合物形成受阻，支架蛋白Axin和腺瘤性结肠息肉病蛋白（APC）形成β-catenin破坏复合物，该复合物通过CK1和糖原合酶激酶-3β（GSK3β）结合胞内β-catenin和促进β-catenin的有序磷酸化，被β-Trcp识别和泛素化，通过蛋白酶体引起凋亡[11]。MMPs是Wnt/β-catenin信号通路的下游基因，同时也是破坏关节软骨细胞外基质（ECM）的主要酶类，当Wnt/β-catenin信号通路被激活后会促进MMPs的过表达[12]。基质金属蛋白酶大致可分为6类，其中基质溶素酶（MMP-3、MMP-10及MMP-11）可以蛋白水解胶原等底物，造成基质损伤[13]。Ⅱ型胶原蛋白是软骨基质的主要组成部分[14]。有研究表明[15]，当MMP-3过表达时会直接破坏关节软骨结构，导致OA的发生。这可能是由于MMP-3表达量升高引起软骨基质中Ⅱ型胶原蛋白的降解，最终导致软骨破坏，加重骨关节炎。

3.3 骨痹通方通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥保护关节软骨的作用

骨痹通方是首都国医名师阎小萍教授治疗骨关节炎的经验方，方中骨碎补、补骨脂补肝肾、壮筋骨；淫羊藿、杜仲、狗脊补肾养温阳作用较强，又兼有祛风除湿强筋骨功效；青风藤、鸡血藤为藤类药，性善走行，具有祛风除痹、舒筋活血作用；土贝母苦寒开泄，制约温补药药性过于猛烈。本研究通过研究骨痹通方干预大鼠膝关节软骨中wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的基因及蛋白表达量，发现经过骨痹通方干预的膝关节炎大鼠关节软骨中的 wnt5a、β-catenin、MMP-3基因表达量较正常组、模型组、盐酸氨基葡萄糖组明显下降（P＜0.05），而正常组、模型组、盐酸氨基葡萄糖组的Ⅱ型胶原酶的基因表达量较骨痹通组明显下降（P＜0.05），模型组、盐酸氨基葡萄糖组 wnt5a、βcatenin、MMP-3的蛋白表达量较正常组明显升高，Ⅱ型胶原酶的表达量明显下降（P＜0.05）。骨痹通组较模型组、盐酸氨基葡萄糖组wnt5a、βcatenin、MMP-3的蛋白表达量显著降低，Ⅱ型胶原酶的蛋白表达量较正常组、模型组、盐酸氨基葡萄糖组明显升高（P＜0.05）。盐酸氨基葡萄糖组的wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的基因及蛋白表达量与模型组差异无统计学意义 （P＞0.05）。表明骨痹通方与盐酸氨基葡萄糖相比，在治疗骨关节炎上疗效更为显著。骨痹通方可以抑制膝骨关节炎大鼠Wnt/β-catenin信号通路激活，减少MMP-3表达，抑制COL-Ⅱ降解，从而发挥对骨关节炎大鼠关节软骨的保护作用。

根据本研究提出2点思考：（1）本研究初步证明骨痹通方对骨关节炎大鼠有治疗作用，但最佳治疗剂量有待进一步探索。（2）骨关节炎的发生机制复杂，与许多影响因素相关，Wnt/β-catenin信号通路只是骨关节炎发病机制中的一条，后期还需要大量研究发现骨关节炎发生的具体机制。