ACE2基因多态性与2型糖尿病肾病的相关性

刘媛媛，姜永玮，杨 辉，丛 笑，曹永彤

（1.中日友好临床医学研究所，北京 100029；2.中日友好医院 检验科，北京 100029）

据国际糖尿病联盟（IDF）统计，中国2017年糖尿病（diabetes mellitus，DM）的患病人数为1.14亿，到2045年将达到1.2亿[1]。糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）作为糖尿病最严重的慢性并发症之一，其患病率也逐年上升，男性的发病率高于女性[2]。ACE与ACE2表达失调被认为可能与DKD的发生发展相关。ACE2基因位于X染色体，相关的动物实验证实ACE2缺乏对不同性别的糖尿病小鼠模型会产生不同的影响，ACE2基因敲除的雄性小鼠可出现血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）介导的肾小球损伤[3]。目前对于ACE2基因多态性的研究较少，本文旨在研究ACE2基因rs2285666多态与不同性别的2型糖尿病（T2DM）患者并发DKD的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选择2016年6月～2018年3月中日友好医院收治的T2DM患者，年龄在62.3±11岁。T2DM的诊断分型参照1999年世界卫生组织（WHO）修订的糖尿病诊断及分型标准，同时排除近期内用过肾毒性药物、妊娠、肿瘤、尿路感染、心力衰竭、活动性结核、精神病等疾病。根据2014年中华医学会糖尿病学分会（CDS）微血管并发症学组工作建议，将符合以下条件的纳入 DKD（+）组：（1）大量白蛋白尿 （诊断标准：ACR＞300，3-6个月内复查，3次结果中至少2次查过临界值，并排除影响因素如24h内剧烈运动、感染、发热、明显高血糖）；（2）糖尿病视网膜病变合并慢性肾脏病[慢性肾脏病诊断标准：GFR＜60ml/（min·1.73m2），且至少满足1条肾脏受损标志：UACR≥30；尿沉渣异常；肾小管相关疾病；组织学异常；影像学所见结构异常；肾移植病史]；（3）满足以上任1条并排除其他疾病引起的蛋白尿及肾功能不全：出现肾损伤但不伴糖尿病视网膜病变；蛋白尿急剧增多或肾病综合征；顽固性高血压；出现尿活动性沉渣等。符合以下条件的纳入DKD（-）组：满足T2DM病程≥10年，且 UACR＜30。

以上全部研究对象均来自中国汉族人群，且无血缘关系。本研究通过本院伦理委员会批准（批号：2016-59），所有研究对象均签署临床研究知情同意书，入选575例研究对象，排除32例（包括符合以上排除标准者28例，失访者4例），共计纳入543例：其中 DKD（+）组 271例，包括男性 145例和女性 126例；DKD（-）组 272例，包括男性134例和女性138例。

1.2 研究方法

1.2.1 临床及生化指标

通过查询病历系统收集患者年龄、性别、身高、体重、体质指数（BMI）、血压、吸烟史及视网膜病变史等临床资料。检索检验科数据库收集患者外周血总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、血肌酐（Scr）、肾小球滤过率（eGFR）、内生肌酐清除率（Ccr）、尿素（Urea）以及尿 UACR 等检测结果。 以上生化项目由Beckman Coulter AU5800全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司）进行检测。

1.2.2 引物设计及合成

采集患者空腹外周静脉血1ml，应用全血基因组DNA快速提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司）提取基因组DNA。根据genbank上ACE2的基因序列，采用引物设计软件primer5设计引物， 上游引物 F：5’-TACAATGAGCACCATCTACAGT-3’，下游引物 R：5’-TACAATGAGCACCATCTACAGT-3’。由北京擎科生物公司合成。

1.2.3 PCR-HRM

仪器采用Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪 （瑞士罗氏公司）；试剂采用Light CyclerR480 High Resolution Melting Master，Version 07（德国罗氏公司）。优化反应条件确定反应体系：总体积为 20μl，包含 Master Mix（2×）10μl，MgCl2（25 mmol/L）2μl，上、下游引物（10μmol/L）各 0.5μl，DNA 模板（10ng/μl）5μl，灭菌超纯水 2μl补足体系。在Light CyclerR480实时荧光定量PCR仪上设置PCR-HRM反应程序如下：①95℃预变性10min。②40个循环的荧光定量Touchdown PCR 程序如下：95℃变性 10s，60℃退火 15s，72℃延伸15s，每次延伸完成后获取1次荧光信号。③HRM程序如下：95℃变性1min，40℃退火1min，65℃～97℃上升 0.02℃/s，每上升 1℃获取 25个信号，获得溶解曲线。④40℃冷却30s完成实验。

1.2.4 目的基因测序分析

①PCR扩增：PCR体系为50 μl，其中包括反应混合物Mix（包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mgcl2、反应缓冲液）25μl，引物混合物 4 l，DNA 样本8μl，灭菌超纯水补足体系。采用TC-C1000 Touch热循环仪（美国Bio-Rad公司）进行扩增，热循环参数为：预变性95℃ 2min；再按下列程序循环30次，即 95℃变性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s；末次循环后，72℃延伸5min。扩增产物送北京擎科生物公司进行测序。②序列比对：将获得的基因序列在PubMed网站的BLAST中进行序列比对，结合HRM结果做出最终判断，以此作为阳性对照进行分型。

表1 DKD（-）组与 DKD（+）组临床资料比较

1.3 统计学方法

研究数据采用SPSS17.0软件进行分析。DKD（+）组和 DKD（-）组 ACE 基因 rs2285666 多态性基因型分布，采用Hardy-Weinberg遗传平衡检验，采用直接计数法计算各组ACE基因rs2285666多态性的基因型和等位基因频率，计数资料组间比较采用χ2检验。对于符合正态分布的计量资料组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料组间比较采用Mann-Whiteney U检验。各组不同基因型受试者的计量资料比较，采用单因素方差分析。多因素分析采用非条件Logisitic回归分析。

2 结果

2．1 受试者相关临床资料比较

DKD（+）组与 DKD（-）组及 2 种基因型的一般临床资料见表1，2组男性患者临床资料比较，年龄、BMI DBP、TC、TG、HDL-C、LDL-C、HCY 差异均无统计学意义（P＞0.05）。 DKD（+）组病程、吸烟比例、SBP、HbA1c、Scr水平高于 DKD （-） 组，eGFR、Ccr低于 DKD（-）组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。女性患者中，病程、吸烟比例、SBP、HbA1c、Scr、HCY 高于 DKD （-） 组，eGFR 低于DKD（-）组，差异均有统计学意义（P＜0.05），其余资料差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 2组受试者ACE基因rs2285666多态性基因型及等位基因频率比较

本研究女性受试者的ACE2基因rs2285666多态性分布，均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律 （P＞0.05）。DNA样品经HRM分析结果见图1（封三）。抽样测序分析结果见图2（封三）。2种方法分型结果保持一致。2组受试者等位基因频率的比较见表2。男性患者中，DKD（+）组G基因频率显著高于 DKD （-） 组 （53.1%比 37.3%，P＜0.01）。 女性患者中，DKD（+）组 GG基因型高于DKD（-）组（28.6%比 15.9%，P＜0.05）。

图1 DNA样品HRM分析结果

图2 ACE2 G8790A测序分析结果

2.3 rs2285666基因分型和DKD的相关性

使用2种统计模型，分别是未校正和校正了病程、 吸烟、SBP、HbA1c、Ccr、eGFR 和 HCY 的影响。表3示，ACE2 G8790A变异增加了DKD风险，其中女性患者在加性遗传模型在DKD（+）和DKD（-）组中的差异有统计学意义（校正后OR=1.56，95%CI=1.03～2.37，P＜0.05）。相对于 AA 和GA基因型，GG基因型在加性遗传模型中均显著提升了DKD的患病风险（P＜0.05）。而男性患者中携带G等位基因进展为DKD的风险显著高于A等位基因（校正后 OR=1.97，95%CI=1.15～3.37，P＜0.05）。

表2 DKD（+）组和 DKD（-）组患者ACE基因型和等位基因频率比较 n（%）

表3 T2DM并发DKD相关因素的Logistic回归分析

3 讨论

DKD是T2DM最主要、最严重的微血管并发症之一，在发达国家30%～40%的糖尿病患者并发DKD，是导致终末期肾脏病（end stage renal disease，ESRD）的首要原因[4]。 在中国，T2DM 并发DKD是导致ESRD的第二位病因（16.4%）[5]。DKD的发病机制尚未明确，主要认为是遗传因素与环境因素共同作用的结果。肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）被认为可以通过改变肾脏血流动力学、参与氧化应激等多种途径参与DKD的发生与进展，相关研究表明DKD患者的肾脏RAS的代偿水平存在性别差异[6]。血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是近年来发现的RAS系统的新成员，是2000年由Donoghue等[7]从心衰患者心室组织的cDNA文库中克隆出一种新的ACE同源物。ACE2基因定位于Xp22，包含18个外显子，该基因的突变可能通过影响性激素而间接影响RAS的表达，从而引起不同性别的DM患者进展为DKD的风险存在差异。Clotet等[8]的实验表明ACE2基因敲除的雄性小鼠可出现肾ACE水平和活性增高，而雌性小鼠无差异。ACE2可对抗ACE与AngⅡ，促进Ang-（1-7）的生成，发挥舒张血管、抗组织纤维化、抗增殖和利尿等作用。在肾脏，局部内皮细胞和肾小管上皮细胞ACE2活性增高，可调节肾血流分布、水电解质的平衡，从而在维持血压稳定的同时保护肾功能。

既往通过对ACE2基因测序检出G8790A（rs2285666）多态位点，即第3个内含子第4个碱基存在G—A突变，该位点的变异可以改变mRNA的剪接，可能对基因的功能产生影响，因此可能与疾病遗传易感性有关，已有的研究表明该位点多态性与高血压伴心功能不全有关。目前国内外对于ACE2基因rs2285666多态性与DKD的关系的研究较少，且结果并不一致，可能与种族差异、研究方法不同有关。既往有关ACE2基因G8790A多态性的研究，多采用PCR-RFLP技术，技术操作繁琐，易造成污染出现假阳性，且结果可能出现拖带影响判读，影响结果的准确性，故有待于进一步改进。本研究采用目前检测SNP较为新型的HRM法，同时随机抽取30例样本进行测序验证，两种方法的检测结果保持一致，表明应用HRM技术检测ACE2基因G8790A多态性是可行的。HRM技术的原理是在PCR扩增前在体系中加入饱和荧光染料，该荧光染料可嵌入至双链DNA间，在激发光的作用下散发荧光，而该染料不与单链DNA结合，在激发光的作用下不发出荧光。随着温度逐渐上升，DNA双链渐打开，荧光强度渐减弱。不同样本的DNA双链因GC含量不同，排列顺序不同，因而呈现出不同的熔解曲线。由于ACE2基因的第3个内含子第4个碱基存在G-A突变，GC间氢键断裂所需的能量与AT间氢键断裂所需的能量不同，因此呈现出不同的熔解曲线。HRM技术的优点在于PCR扩增完成后只需运行一个升温程序即可完成检测，且结果准确、成本较低、操作简便、可以达到闭管操作从而避免污染，因此是一种快速、准确检测ACE2基因G8790A基因多态性的优选方法。

Frojdo等[9]用PCR-RFLP法分析了芬兰地区823例糖尿病患者ACE2基因G8790A多态性与DKD的关系，其中包括365例DKD和458例非DKD患者，结果表明DKD组与非DKD组的基因分布无明显差异，该位点突变与DKD无关。马增霞等[10]采用PCR-RFLP法的研究认为DKD组男性患者A基因频率（59.6%）明显升高，G基因频率（40.4%）显著降低（P＜0.05）。携带 A 等位基因的T2DM男性患者更易发生DKD，G等位基因则为保护性基因。本研究应用HRM法对2型糖尿病合并DKD患者271例及2型糖尿病不伴DKD患者272例进行了ACE2基因rs2285666多态的分析，观察到男性患者中G等位基因的频率在DKD患者中明显升高（P=0.008）。在校正了病程、吸烟 、SBP、HbA1c、Ccr、eGFR 和 HCY 等的 影响后，发现在女性患者加性遗传模型中，G等位基因在两组间的差异有统计学意义（P=0.03），GG基因型在加性遗传模型中显著提升了DKD的患病风险（P＜0.05）。 该结果与 Li等[11]的研究结果保持一致。在男性患者中，DKD（+）组携带G基因频率显著高于 DKD（-）组（校正后 P=0.013），因此，G 基因是男性DKD发病的独立危险因素。本研究对2型糖尿病合并DKD患者271例及2型糖尿病病程≥10年且不伴DKD患者272例进行了ACE2基因rs2285666多态性的研究，具有比较好的统计学效力，但仍有一定局限性。本研究是在汉族2型糖尿病患者中进行的，结果是否可以推广到其他民族，还需要进一步的调查。本研究为病例对照研究，还需要开展大样本前瞻性研究，并进一步检测不同基因型的酶表达水平来验证rs2285666基因型与DKD的关系。

DKD发病机制尚未完全阐明，本研究提示遗传因素在2型糖尿病患者DKD的发病中具有一定的作用，对于ACE2基因 rs2285666多态性的研究有可能为DKD的基因诊断及治疗提供依据，本研究同时为该多态性的研究提供了新的方法，只有明确遗传易感个体，尽早进行相关的干预治疗，才能控制和延缓DKD进展、改善患者的生活质量及减轻社会的的经济负担，ACE2基因rs2285666多态性与DKD的关系还需要进一步开展大样本前瞻性研究加以验证。