冷冻胚胎复苏后发育情况与妊娠结局的关系

沈智君， 张迅轶， 杨 峰， 杨 敏， 陈子昂， 纪亚忠

(同济大学附属同济医院生殖医学中心，上海 200065)

自1983年世界首例冻融胚胎移植试管婴儿获得成功妊娠以来，冷冻胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)技术作为体外受精-胚胎移植的常规治疗技术之一，已广泛应用于人类辅助生殖技术领域。FET在预防卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)的发生、提高累积妊娠率、减少促排卵次数、降低异位妊娠风险等方面具有重要意义，而影响FET妊娠率的主要因素包括年龄、临床用药方案、胚胎质量、子宫内膜的容受性以及胚胎与子宫内膜的同步化等，其中胚胎质量是决定FET成功的重要环节之一[1-2]。另外，FET的实施方案可分为当天解冻并移植以及解冻后培养18～20h后移植，并按照指南的标准对解冻后及过夜培养后的胚胎质量进行评分[3]。本研究通过观察胚胎解冻并过夜培养18～20h后卵裂球的增殖情况，计算卵裂球的增殖比例，分组进行分析及探讨其与FET妊娠结局的相关性，以期为判断胚胎的发育潜能及临床妊娠结局提供更多的参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月—2016年12月在同济大学附属同济医院生殖医学科行FET的周期，纳入研究的临床及实验室标准为： (1) 女方因盆腔输卵管、排卵障碍、子宫内膜异位症等因素，或免疫因素、不明原因等不孕，以及男方因少、弱、畸精或无精症等因素不育；(2) 所有内膜准备方案均为人工周期的冷冻胚胎移植周期；(3) 所有解冻移植的胚胎均为授精后72h的第3天(D3)卵裂期胚胎；(4) 解冻后培养时间为18～20h；(5) 2枚胚胎均解冻后均有≥50%的卵裂球存活的复苏胚胎；培养后均有卵裂球增殖或与解冻后卵裂球数量相同，无逆分裂或卵裂球数少于解冻后现象；2枚胚胎均予以移植。

1.2 方法

1.2.1 内膜准备及移植 均采用人工周期进行移植前内膜准备。月经周期第2～3天行阴道超声，根据患者基础内分泌激素和内膜情况采用戊酸雌二醇行人工周期治疗，黄体酮转化内膜3d后移植。

1.2.2 玻璃化冷冻、解冻及胚胎培养 使用Origio玻璃化冷冻试剂盒(MEDICULT，丹麦)对D3卵裂期胚胎进行冷冻。该试剂盒包括平衡液和玻化液，所有操作于室温进行，将胚胎置于平衡液中，胚胎经历从皱缩到重新扩张的过程，大约5min后转移至玻化液，并在1min内装载于载杆前端，立即投入液氮保存。在拟移植时间的前18～20h解冻胚胎，使用Origio玻璃化解冻试剂盒对D3卵裂期胚胎进行解冻。该试剂盒包括解冻液、稀释液1、稀释液2及洗涤液，将胚胎从液氮中取出，置于37℃的解冻液中，随后每隔3min依次将胚胎转移至室温的稀释液1、稀释液2及洗涤液中，最后转入37℃的含人血清替代品(Synthetic Serum Substitute Irvine，美国)的胚胎培养液(Continuous Single Culture， Irvine，美国)中继续培养18～20h，培养环境为37℃、5% CO2及5% O2(ASTEC 30L三气培养箱，ASTEC，日本)。

1.2.3 胚胎分级评估及卵裂球增殖计算方式 结合伊斯坦布尔胚胎评分标准及中心实验室经验，根据卵裂球数、碎片量、卵裂球大小均一性等对所有纳入研究的胚胎进行冷冻前、解冻后及培养后的评级[3]。I级胚胎： 7～9细胞，卵裂球大小均匀，碎片<5%，无空泡；Ⅱ级胚胎： ≥6细胞，卵裂球大小均匀或大致均匀，碎片5%～10%，无或有少量空泡；Ⅲ级胚胎： ≥5细胞，卵裂球大小不均匀，碎片10%～20%，可有空泡；Ⅳ级胚胎： ≤4细胞或碎片>20%，卵裂球大小不均匀。另外，使用公式[(培养后卵裂球数量-解冻后卵裂球数量)/解冻后卵裂球数量]×100%，计算胚胎培养后卵裂球的增殖百分率。

1.2.4 胚胎分组 本项研究分析了纳入统计周期的女方患者年龄、不孕年限、BMI、移植日内膜厚度及复苏胚胎继续培养的胚胎增殖情况，其中胚胎增殖分组： (1) 根据移植的2枚胚胎卵裂球是否增殖，分为0枚生长组(S0)；1枚生长组(S1)及2枚生长组(S2)。(2) 在2枚生长组(S2)中，根据卵裂球增殖情况或增殖百分比。分为a组： 增殖形成桑葚胚或早期囊胚；b组： 卵裂球增殖率≥50%；c组： 50%>卵裂球增殖率≥25%；d组： 卵裂球增殖率<25%，移植2枚胚胎，则分为aa、ab、ac、ad、bb、bc、bd、cc、cd、dd共10组。

1.2.5 确定妊娠及随访 移植后12d检测血β-hCG，若血β-hCG>5 IU/L提示生化妊娠，48h后复查翻倍情况，若翻倍良好则继续黄体支持；若血β-hCG<5 IU/L，则停药待月经。移植后28d阴道超声检查，见孕囊、胚芽、心管搏动者确定为临床妊娠，继续黄体支持至妊娠10～12周，并随访至活产。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 一般临床结果

本研究经纳入条件筛选，共选取991个FET周期，女性患者平均年龄为(32.90±6.25)岁，临床妊娠周期424个，临床妊娠率(临床妊娠周期/周期数)42.79%；移植胚胎1982枚，孕囊数535个，胚胎种植率(孕囊数/移植胚胎数)26.99%；多胎妊娠75例，多胎妊娠率(多胎妊娠周期数/临床妊娠周期数)17.69%；流产率(流产周期数/临床妊娠周期数)28.3%。年龄在各个分组间差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 培养后2枚胚胎卵裂球是否增殖与妊娠结局的关系

胚胎解冻经18～20h培养后移植，S2组的临床妊娠率和胚胎种植率显著高于S1组(P<0.01)，而S1组又显著高于S0组(P<0.01)；同时，S1组的流产率显著高于S2组(P<0.01)；另外，S2组的多胎妊娠率显著高于S1组(P<0.01)，见表1。

表1 培养后胚胎卵裂球是否增殖与妊娠结局的关系

与S1组相比，*P<0.01；与S0组相比，#P<0.01。

2.3 培养后2枚胚胎卵裂球的增殖情况或增殖百分比与妊娠结局的关系

在胚胎解冻培养后移植的S2组中，进一步发现妊娠率的变化趋势分为3个区段，第一个区段(A区段)包含aa、ab、ac、ad组；第二个区段(B区段)包含bb、bc、bd组；第三个区段(C区段)包含cc、cd、dd组，此3个区段的妊娠率分别随着各组内2枚胚胎中另一枚卵裂球增殖比例的降低而降低，其妊娠率差异有统计学意义(P<0.01)，；另外，3个区段的平均妊娠率之间差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 培养后胚胎卵裂球的增殖情况或增殖比例与妊娠结局的关系

(续表2)

与aa组相比，*P<0.01；与bb组相比，#P<0.01；与cc组相比，△P<0.05。

2.4 Logistic分析结果

将本项研究纳入的其他参数，即采卵时女方年龄、体质量指数(body mass index, BMI)、不孕年限及移植日内膜厚度作Logistic分析，结果提示女方年龄与妊娠显著相关(P<0．05)，见表3。

表3 与临床妊娠相关的多因素Logistic回归分析结果

3 讨 论

随着胚胎玻璃化冷冻技术的日益成熟，玻璃化冷冻的胚胎复苏率可达98%以上，使冷冻胚胎移植的妊娠率得到极大的提高[4]。影响胚胎种植的因素很多，其中胚胎质量是影响移植成功率非常重要的因素之一[5]。按照指南，胚胎质量可以从卵裂球数量、胚胎碎片、卵裂球均一性等角度进行评判，而与胚胎发育天数相符合的卵裂球数量又是影响胚胎质量评分的重要依据[3]。在FET操作中，延长解冻后胚胎的培养时间，可进一步观察其发育潜能[6]，目前对于培养后胚胎质量的评价依然使用指南的静态标准，缺乏反映其发育潜能的动态指标(如培养前后发育情况对比)，很难对培养后胚胎的发育潜能作出客观的评判及进一步的移植胚胎选择。本研究从培养后卵裂球数目的客观依据出发，计算出培养前后胚胎卵裂球增殖的比例，分析该比例与妊娠结局的关系。

所有解冻的胚胎均为受精后72h的卵裂期胚胎，在其继续生长的18～20h内有较明确的增殖状态或者卵裂球增殖数目等客观指标；纳入研究的解冻后胚胎均为有≥50%卵裂球存活的复苏胚胎，若有>50%卵裂球凋亡或溶解则判定为复苏失败，或培养后若出现逆分裂(reverse cleavage)或卵裂球数少于解冻后的情况，通常该情况会取消移植[7]。

本研究发现移植2枚胚胎均有卵裂球增殖的移植组(S2组)，其种植率、妊娠率均明显高于只有1枚发育胚胎的移植组(S1组)和无卵裂球增殖组(S0组)，且流产率明显低于S1及S0组；提示对复苏后胚胎进一步培养观察卵裂球是否增殖，对临床冷冻复苏周期的胚胎选择具有参考意义。研究从解冻培养后胚胎卵裂球增殖比例的角度出发，发现临床结局的变化趋势明显分为三个区段，在移植的2枚胚胎中至少有1枚发育到早期囊胚阶段的A区段，无论与其一起移植的另一枚胚胎发育情况如何，均能获得理想的临床妊娠率及较低的流产率，提示了单囊胚移植的可行性；在移植的2枚胚胎中有1枚的卵裂球增值率>50%而未达到早期囊胚阶段，另一枚增值率较其更低的B区段，也能获得较好的临床妊娠率，然而流产率却随着另一枚胚胎卵裂球增值率的下降而有所升高；最后，在移植的2枚胚胎中至少有1枚的卵裂球增值率在25%和50%之间或者<25%，另一枚增值率较其更低的C区段，临床妊娠率进一步降低，在dd组，流产率甚至可高达50%。有研究[8]表明，人类胚胎在基因组激活主要发生在受精后发育第3天，在胚胎基因组激活后开始致密化形成桑葚胚，故复苏24h仍无卵裂球增殖或低增值率的胚胎，其染色体异常率可达80%以上，这可能是本研究中流产率随着胚胎卵裂球增殖率的下降而增高的原因。

由此可见，解冻后经培养18～20h的胚胎发育情况与妊娠结局相关，但还需增加样本量来进一步研究论证。冷冻复苏后的胚胎若能恢复胚胎良好的发育状态，则预示其有较好的临床结局。所以，通过延长体外培养时间，评估胚胎卵裂球的增值潜能，筛选出较优质胚胎，为临床结局提供参考。