叔丁基对苯二酚对急性肺损伤小鼠的保护作用

陈冠楠，魏 娟，刘美云，周焕平，吕 欣

(同济大学附属上海市肺科医院麻醉科，上海 200433)

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)及其严重形式急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是临床上常见的急危重症。在过去的几十年里，尽管人们对ALI的病因、发病机制和临床防治等有了一定的认识，但ALI/ARDS患者的死亡率仍高达30%～50%[1]。炎症反应平衡紊乱是ALI的主要原因[2]。因此，早期如何有效地干预过强的炎症反应，阻止ARDS的发生，是目前该领域的研究热点之一。

叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone, tBHQ)是一种合成酚类抗氧化剂,主要通过激活核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)的表达来发挥抗氧化功能[3]。之前的研究报道了tBHQ在心、脑及肝脏组织损伤中通过抑制氧化应激反应发挥保护作用[4-5]。但tBHQ对ALI的作用尚不清楚。Nrf2是含有亮氨酸拉链结构的核转录因子，主要调控机体抗氧化应激反应[6]，已有研究表明Nrf2在ALI中发挥重要作用[7]，且Nrf2在先天性免疫反应调节中也起重要作用[8]。本研究通过脂多糖(lipopolysachride, LPS)腹腔注射建立小鼠ALI模型旨在探索tBHQ对炎症反应调节和ALI的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验采用6～8周无特异病原体(SPF)级C57BL/6J雄性小鼠98只，体质量19～21g，购自上海必凯实验动物有限公司，饲养于同济大学附属上海市肺科医院动物实验中心，实验动物在光照-黑暗交替(12h∶12h)，室温维持在20～24℃，相对湿度50%～60%的饲养箱中适应性饲养1周。

1.2 实验方法

1.2.1 LPS腹腔注射诱导ALI模型 将小鼠按照不同的实验方案随机分配为对照组(control组)、LPS组、磷酸盐缓冲液(PBS)组、PBS/tBHQ组、LPS/tBHQ组、tBHQ+LPS/tBHQ组。配制不同浓度的LPS(美国Sigma公司)溶液(1mg/mL、2mg/mL)，直接腹腔注射诱导ALI模型[9]，LPS的剂量分别为低浓度10mg/kg和高浓度20mg/kg。空白对照组不做任何处理。LPS组10或20mg/kg LPS腹腔注射，PBS组等体积腹腔注射，LPS/tBHQ组同时给予tBHQ与LPS，PBS/tBHQ组同时给予tBHQ与PBS，tBHQ+LPS/tBHQ组预先24h腹腔给予tBHQ并在LPS诱导时同时给予tBHQ。tBHQ(美国MedChem Express公司)腹腔注射剂量为50mg/kg[10]。按照实验需求，分别观察小鼠7d生存率，在不同的时间点(3、8、24h)取标本，进行下一步实验。

1.2.2 样本采集 LPS处理后不同时间点(3、8、24h)分别用眼球取血的方法采集小鼠外周血，置于4℃冰箱静置2h后，离心半径15cm，5000r/min，4℃，离心10min，吸取上清液分装，-80℃保存备用。眼球取血后颈椎脱臼处死小鼠，取左肺置于4%多聚甲醛固定液中固定、脱水、平铺包埋最大面用来病理学检测，右肺置于1mL TRIzol中提取RNA，实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肺组织中目的基因的mRNA水平。

1.2.3 血清中的IL-6、TNF-α及IL-10的检测 采用多重液相蛋白定量技术即CBA法检测LPS处理后不同时间点(3、8、24h)血清中细胞因子的变化(IL-6和TNF-α)以及LPS处理后3h时血清中IL-10的变化。利用Accuri C6型流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)，在488nm(蓝色)和640nm(红色)的条件下，检测微球的位置和荧光信号强度。血清中的抗体以荧光强度均值为基础，转化为浓度(ng/L)。

1.2.4 RT-qPCR检测目的基因表达 提取肺组织总RNA，按照日本TaKaRa公司Prime Script RT reagent Kit反转录试剂盒说明书进行37℃反转录15min，85℃转录酶灭活5s，4℃反应终止。目的基因的表达采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和ABI 7500 PCR系统检测，运用相对定量法比较不同组IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA水平差异，以β-actin作为内参，表达差异的计算为2-ΔΔCt。β-actin上游引物5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′，下游引物5′-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3′；IL-6上游引物5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′，下游引物5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′；TNF-α上游引物5′-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3′，下游引物5′-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3′;IL10上游引物5′-GCTCTTACTGACTGGCATGAG-3′,下游引物5′-CGCAGCTCTAGGAGCATGTG-3′。

1.2.5 Western印迹法检测Nrf2蛋白的表达 LPS处理后3h，处死小鼠，提取肺组织，按试剂盒步骤提取组织核蛋白，蛋白定量采用BCA蛋白定量试剂盒。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜，孵育Nrf2特异性一抗(1∶1000,12721S,美国CST公司)，相应二抗孵育后，洗膜，化学发光显色分析各组中Nrf2蛋白的表达情况，以核内蛋白Lamin A/C(1∶1000;sc-376248,美国Santa Cruz公司)为内参。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组小鼠7d生存率比较

小鼠给予低剂量LPS(10mg/kg)腹腔注射，7d内生存率为80%。LPS/tBHQ组和tBHQ+LPS/tBHQ组小鼠的7d生存率均有提高，均为100%，但差异均无统计学意义(与LPS组相比，P=0.3713)，见图1A。当小鼠给予高剂量的LPS(20mg/kg)时，2d 内全部死亡；而LPS/tBHQ组小鼠的7d生存率为60%(与LPS组相比，P=0.0005)；tBHQ+LPS/tBHQ组小鼠的7d生存率为100%(与LPS组相比，P=0.0001)，见图1B。因此，随后的实验中将使用非致死LPS剂量10mg/kg，探究tBHQ的潜在保护作用。

图1 小鼠7d生存率(n=8)Fig.1 The mortality of mice treated with(n=8)A： 低剂量(10mg/kg)LPS腹腔注射；B： 高剂量(20mg/kg)腹腔注射

2.2 LPS组不同时间点小鼠肺组织和血清中IL-6和TNF-α水平检测

上述结果显示,ALI小鼠的死亡主要是集中在LPS后48h内。肺组织中促炎细胞因子IL-6和TNF-α的mRNA水平在LPS处理后3h时最高，随着时间的增加逐渐下降，见图2A、2B。此外，血清中IL-6和TNF-α的浓度变化是一致的，见图2A、2B。因此，本研究将LPS处理后3h作为后续研究的时间点。

图2 LPS单独处理后不同时间点小鼠肺组织和血清中IL-6(A)和TNF-α(B)水平变化Fig.2 LPS induced changes of the IL-6(A) and TNF-α(B)in the mouse lung tissues and serum与control组相比,*P<0.05;**P<0.01;n=6

2.3 各组小鼠肺组织病理检查结果

H-E病理学检查结果显示，与空白对照组相比，PBS不会引起肺组织病理损伤；LPS处理3h后，小鼠肺组织出现严重损伤，正常肺泡结构减少，炎症细胞浸润及肺泡间隔增厚。而LPS/tBHQ组和tBHQ+LPS/tBHQ组小鼠肺组织的损伤程度均明显减轻，见图3。

2.4 各组小鼠各因子在肺组织及血清中表达情况

与空白对照组相比，LPS腹腔注射3h后，LPS组小鼠肺组织中的炎症因子IL-6(P=0.0004)和TNF-α(P=0.0002)的mRNA水平明显升高，见图4A；与LPS组相比，LPS+tBHQ组小鼠肺组织中IL-6(P=0.036)和TNF-α(P=0.0002)mRNA水平明显降低，同时，tBHQ+LPS/tBHQ组小鼠肺组织中IL-6(P=0.009)和TNF-α(P=0.0002)mRNA水平也明显降低(图4A)。与空白对照组相比，LPS处理3h后肺组织中抗炎因子IL-10的mRNA表达升高(P=0.0005)，而与LPS组相比，LPS+tBHQ组和tBHQ+LPS/tBHQ组小鼠肺组织中IL-10的mRNA水平均明显升高(P分别为0.0002和0.0003)，见图4A。同样地，小鼠血清中炎症因子IL-6和TNF-α的浓度水平变化与肺组织中mRNA水平变化一致，而t小鼠血清中抗炎因子IL-10的浓度变化也与肺组织中mRNA水平变化一致，见图4B。

图3 LPS腹腔注射3h后各组小鼠肺组织病理切片(H-E,×100)(n=6)Fig.3 Lung tissue sections were prepared at 3h after LPS injection and stained with hematoxylin-eosin(H-E,×100)(n=6)

图4 小鼠肺组织和血清中IL-6、TNF-α及IL-10的表达Fig.4 Expression of lL-6, TNF-α and IL-10 in lung tissues and serum*P<0.05;**P<0.01;n=6

2.5 各组小鼠肺组织Nrf2 mRNA表达情况

与对照组相比，单纯tBHQ处理没有增加肺组织Nrf2的mRNA水平(P=0.565)，见图5A；LPS处理3h时可明显降低肺组织中Nrf2 mRNA水平(P=0.010)，tBHQ与LPS同时处理与LPS组相比，Nrf2 mRNA水平明显升高(P=0.011，图5A)。Western blot结果显示，单纯tBHQ处理与对照组相比，明显增加核内Nrf2蛋白表达(图5B)；单纯LPS处理组与对照组相比，核内Nrf2蛋白表达减少，而tBHQ与LPS同时处理组可明显增加核内Nrf2蛋白水平，见图5B。

图5 RT-qPCR和Western印迹法检测肺组织中Nrf2水平Fig.5 Levels of Nrf2 in lung tissues were detected by RT-qPCR and Western blotting*P<0.05;n=6

3 讨 论

ALI和ARDS是由多种原因导致的急性呼吸功能障碍，ARDS患者的主要病理表现为弥漫性肺泡损伤,肺透明膜形成、肺泡蛋白水肿液，过度的炎症细胞和炎症细胞因子的释放[11]。目前，ARDS确切的发病机制尚不清楚。大量的研究证明，机体失控的全身炎症反应，过度活化的细胞免疫和体液免疫反应，往往导致细胞损伤和死亡，参与ARDS的发病过程[12]。尽管目前多种支持治疗策略有了很大的进展，但ARDS病死率仍居高不下[13]。本研究结果表明LPS诱导前24h使用tBHQ并同时LPS腹腔注射时再次使用和LPS诱导时同时给予tBHQ可显著降低LPS诱导的ALI小鼠死亡率，减轻肺组织损伤，明显减少肺组织和血清中促炎细胞因子的表达(IL-6和TNF-α)，同时增加抗炎细胞因子(IL-10)表达。此外，tBHQ还可拮抗小鼠肺组织中LPS对Nrf2核转位的抑制。

抗氧化剂tBHQ在多种细胞和组织损伤中发挥保护作用，减轻氧化应激损伤导致的细胞功能障碍[14]。本实验探讨了tBHQ对ALI小鼠的作用，结果表明，tBHQ能显著降低高剂量LPS腹腔注射诱导的ALI小鼠死亡率，且小鼠死亡主要集中在急性期。据此，本研究检测了LPS处理早期不同时间点(3、8、24h)下小鼠肺组织和血清中炎症因子水平(IL-6和TNF-α)，结果表明小鼠肺组织或血清中炎症因子水平随着时间的推移逐渐降低。ARDS急性炎症早期常表现为“炎症因子风暴”，主要是固有免疫发挥作用，炎症细胞早期释放促炎细胞因子清除病原菌，后期则通过分泌抗炎细胞因子促进组织修复，拮抗过强的炎症反应[15]。随着研究的不断深入，单一的阻断细胞因子、病原体识别或炎症信号通路等治疗ARDS的临床试验均以失败告终[16]，研究免疫平衡调节，已成为探究ALI/ARDS发生、发展以及治疗的重要途径。

本研究结果显示，tBHQ通过下调肺组织和血清中促炎基因IL-6和TNF-α的表达以及上调抗炎基因IL-10的表达来调节ALI小鼠的炎症反应平衡，从而减轻ALI小鼠的肺组织损伤。ARDS急性炎症早期，活化的免疫细胞释放大量的促炎细胞因子(如IL-6、IL-12和TNF-α等)清除病原菌[17]，同时抗炎细胞因子(IL-10)拮抗炎症反应，减轻组织损伤[16]。细菌感染和内毒素诱导激活多种免疫细胞异常分泌趋化因子和细胞因子，通过激活经典Toll样受体4(TLR4)信号通路激活核因子NF-κB，诱导炎症级联瀑布反应，最终导致全身炎症反应，并引起肺组织严重损伤[18]。因此，ARDS急性期控制机体异常免疫反应，调节机体促炎、抑炎反应平衡将有助于治疗ARDS，改善ARDS的治疗前景。

此外，tBHQ单独给予未增加小鼠肺组织中Nrf2 mRNA水平，但可促进肺组织中Nrf2的核转位。在LPS诱导的ALI急性期(3h)时，LPS不仅抑制肺组织中Nrf2 mRNA的水平同时也抑制其核转位，与已有的研究一致[19]。而给予小鼠LPS诱导后同时tBHQ处理，不仅可增加肺组织中Nrf2的mRNA水平也可促进Nrf2的核转位。这些结果表明，tBHQ降低ALI小鼠死亡率，调节小鼠体内抗炎、抑炎反应，进而减轻ALI可能与促进Nrf2核转位有关。tBHQ可激活抗氧化反应元件和上调Nrf2的表达来减轻神经系统损伤[4]。tBHQ还可增加Nrf2蛋白稳定性，激活Nrf2核转位发挥抗氧化功能。Nrf2作为一种含亮氨酸拉链结构的核转录因子，不仅调控机体抗氧化应激反应、促进细胞保护性基因的转录[6]，同时还在ALI中发挥抗炎作用[7]。本研究表明，tBHQ可能通过激活Nrf2，促进其核转位，降低ALI小鼠死亡率，减轻其肺组织损伤程度，调节炎症免疫平衡。然而，tBHQ的抗氧化应激作用不能被排除，仍需更进一步的研究。

综上所述，通过腹腔注射LPS建立ALI小鼠模型，tBHQ可降低ALI小鼠的死亡率，抑制促炎细胞因子的表达，促进抗炎细胞因子的表达，显著减轻肺组织损伤，其机制可能与促进Nrf2核转位有关，为临床预防和治疗ALI提供了新的思路。