JNK信号通路在小鼠术后肠麻痹发病机制中的作用

张瑞琴， 林思思， 陈春球， 李 琨， 李永渝

(1. 同济大学医学院病理生理学教研室—同济大学消化系疾病研究所，上海 200092； 2. 山西医科大学第二医院西院病理科，太原 030053； 3. 同济大学附属第十人民医院外科，上海 200072)

术后肠麻痹(postoperative ileus, POI)是指腹部或非腹部手术引起的胃肠运动功能紊乱，以腹痛、腹胀、恶心、呕吐及排气排便延迟为主要症状[1]。POI的发生增加了患者术后并发症的发生率，导致部分患者住院时间延长和医疗费用增加[2]。迄今为止，POI的发病机制仍未完全阐明，因此，对POI发病机制的研究可望为其有效防治提供理论和实验依据。

研究揭示，炎症反应是参与POI发生发展的主要机制之一。核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)等炎症相关信号通路的激活，导致大量炎症介质的释放，包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)等[3-5]。这些炎症介质以及炎细胞的浸润引起肠道组织尤其是肠道肌层受损，进而干扰肠道运动功能；此外，持续的炎症反应还可引起肠屏障损伤，进一步引起局部炎症反应的蔓延，加重肠道病变，严重时甚至引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，从而危及生命[6]。p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信号通路是MAPK信号通路中两个主要的分支。研究[4-5]发现，p38MAPK参与了POI的炎症反应，JNK信号通路在多种炎症性疾病中的作用已有报道[7-8]，然而其在POI发病中的作用仍不清楚。

本实验通过采用经典的小肠干扰术(intestinal manipulation, IM)，在C57/BL6野生型(wide type, WT)和同品系的JNK基因敲除(JNK-/-)小鼠诱导肠麻痹模型，通过检测小肠排推率、组织病理学改变、炎症介质水平以及连接蛋白Claudin-2表达水平，初步探讨JNK信号通路在POI发生发展中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

成年C57/BL6 WT小鼠及其相同背景的JNK-/-小鼠各12只，体质量18～23g，雌雄各半，由上海海军军医大学病理生理教研室章卫平教授提供。动物饲养于同济大学动物实验中心无特定病原体级(SPF级)动物房，室温(25±3) ℃、湿度55%±5%，保持12h光照，给予标准实验饮食、自由饮水。

1.2 主要试剂和仪器

MPO、IL-1β和IL-6的酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒均购自深圳达科为生物技术公司；Western印迹法产品购自碧云天生物技术公司；Claudin-2抗体购自美国Santa Cruz CST公司；β-actin抗体购自美国CMCTAG公司；抗小鼠抗体购自上海Abmart公司；抗兔抗体购自CWRIO公司；酶标仪购自美国Thermo Scientific公司；ImageQuant LAS 4000化学发光成像分析仪购自美国GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分组及POI模型构建 实验前小鼠禁食12h禁水4h，参照文献[4]的方法诱导POI模型。WT和JNK-/-小鼠随机各分为2组，每组6只： (1) POI组，用恩氟烷麻醉小鼠后仰卧置于手术台上，沿腹中线进行剖腹手术，轻柔提出小肠放到已浸泡过生理盐水的湿纱布上，用两根微湿的棉花棒头端对小肠从屈氏韧带到回肠末端来回触摸3次，每次来回约5min，干扰共15min后将小肠回纳入腹腔，双层缝合腹壁；(2) 假手术组(Sham组)，开腹后仅轻柔地将小肠从腹腔取出并置于湿润的棉布，不对其进行触摸刺激。

1.3.2 肠道运动功能检测 小鼠腹部手术后24h，参照文献[9]方法分别给小鼠按每10g体质量灌胃0.1mL碳末-阿拉伯胶混悬液(10%碳末悬液∶10%阿拉伯胶悬液)，20min后麻醉处死小鼠，立即开腹取出胃幽门至盲肠端小肠，测量碳末移行距离和小肠总长度，小肠的排推率(%)=碳末移行距离/小肠总长度×100。

1.3.3 肠道病理组织学的观察 剪取约1cm小鼠回肠肠段，固定于4.2%～4.6%甲醛溶液中，进行常规脱水、石蜡包埋、组织切片及苏木精-伊红(H-E)染色。光学显微镜下观察肠组织形态及局部炎症情况。

1.3.4 小肠炎症介质水平检测 取适量的小鼠回肠组织，并按照MPO、IL-1β及IL-6的ELISA试剂盒产品说明书加入磷酸盐缓冲液(PBS)进行匀浆，2000r/min，4℃离心20min，取上清液并按试剂盒说明书进行加样和检测。

1.3.5 Western blotting法检测小肠组织Claudin-2蛋白表达 取适量的小鼠回肠组织并加入蛋白裂解液，进行匀浆并使之充分裂解后，2000r/min，4℃离心20min，取上清液。使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，加入含十二烷基硫酸钠(SDS)的上样缓冲液，95℃变性10min。参照文献[5]方法上样本量25μg，完成SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及转聚偏氟乙烯(PVDF)膜操作，之后用5%脱脂牛奶封闭2h，TBST洗涤后PVDF膜与一抗Claudin-2抗体(1∶100稀释)及β-actin抗体(1∶5000稀释)在4℃下孵育过夜。TBST洗涤后PVDF膜在室温下与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶5000稀释)孵育1h。化学发光法(ECL)显色后，使用ImageQuant LAS 4000化学发光成像分析仪曝光、采集图像，用Image J软件对Western印迹法结果进行灰度值半定量分析。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 肠道运动功能的变化

两种小鼠Sham组之间的小肠排推率差异无统计学意义(P>0.05)；与各自的Sham组相比，两种小鼠造模后小肠排推率均明显下降(P<0.05)；然而，对于POI小鼠，JNK-/-小鼠的小肠运动功能明显好于WT小鼠的(P<0.05)，说明JNK基因敲除后可以改善小肠运动功能，见图1。

图1 WT和JNK-/-小鼠小肠排推率的变化Fig.1 Alterations of gastrointestinal transit in WT and JNK-/-mice与Sham组相比，*P<0.05；与WT的POI组相比，#P<0.05

2.2 小肠组织病理学的改变

WT和JNK-/-小鼠的Sham组回肠黏膜绒毛及隐窝结构正常，黏膜内少量淋巴细胞及浆细胞浸润；POI造模后，两种小鼠的回肠黏膜内存在大量淋巴细胞及浆细胞，黏膜下间质水肿。与JNK-/-小鼠POI组比较，WT小鼠POI组病理改变更为严重，同时还有回肠黏膜绒毛结构紊乱，杯状细胞数量减少的情况，见图2。

图2 WT和JNK-/-小鼠回肠病理学改变(H-E,×100)Fig.2 Pathological changes in ileum of WT and JNK-/- mice(H-E,×100)→所示淋巴细胞

2.3 各组小肠组织MPO、IL-1β、IL-6水平

POI造模后，WT小鼠回肠组织的炎症介质MPO、IL-1β、IL-6水平均明显升高(P<0.05)；JNK-/-小鼠的MPO水平有明显增高(P<0.05)，但IL-1β及IL-6水平升高不明显(P>0.05)；与WT造模组的相比，JNK-/-小鼠造模组回肠组织的MPO、IL-1β、IL-6水平均较低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 WT和JNK-/-小鼠回肠炎症介质水平的改变Fig.3 Levels of inflammatory mediators in ileum of WT and JNK-/-mice与Sham对照组相比，*P<0.05；与WT的POI组相比，#P<0.05

2.4 各组小肠Claudin-2连接蛋白的表达

与同种小鼠的Sham组(WT小鼠为0.183相对灰度值与JNK-/-小鼠为0.199相对灰度值)相比，WT小鼠POI组回肠Claudin-2蛋白表达(0.337相对灰度值)明显增高(P=0.036，P<0.05)，而JNK-/-小鼠POI组(0.186相对灰度值)无此变化(P=0.804，P>0.05)。而WT小鼠POI组回肠Claudin-2蛋白表达明显高于JNK-/-小鼠POI组(P=0.004，P<0.01)，见图4。

图4 WT和JNK-/-回肠Claudin-2蛋白的表达Fig.4 Claudin-2 protein expression in ileum of WT and JNK-/-mice

3 讨 论

近年来，POI发生机制的研究取得了一定的进展，但仍未阐明。目前研究认为POI的发生发展主要与以下因素有关： 神经调节紊乱、炎性介质过量释放和胃肠激素分泌异常等[10]。研究表明，麻醉剂的使用、手术操作及疼痛等刺激引起交感神经过度兴奋，抑制肠道平滑肌；同时，交感-副交感神经平衡失调，抑制肌间神经丛兴奋和乙酰胆碱释放，从而抑制术后肠运动，但是神经机制的调控是个短暂的过程，不能完全解释术后3～5d的肠麻痹过程[11-12]。20世纪90年代，Kalff等[13]研究发现，肠道肥大细胞、巨噬细胞的激活及炎症反应在POI发生发展中具有重要作用，并且肠道肌层的炎症反应程度是决定POI持续时间的关键因素之一。本课题组前期实验揭示，持续性的炎症反应导致肠道肌层和肠屏障受损。MAPK信号通路的激活导致大量炎症介质释放，甚至从肠道通过血液系统扩散到全身[5]。

肠道不仅仅是消化和吸收营养物质的主要器官，而且具有重要的屏障功能，在抵抗外来抗原物质对机体的侵袭、维持肠道稳态中发挥着重要作用。炎症介质及炎性细胞的浸润常是导致肠屏障受损的主要原因[14-15]；同时，肠黏膜损伤、缺血、氧自由基产生、炎细胞激活，均可引起肠黏膜通透性增加，肠道微生物菌群失调，进而引发或加重肠道炎症反应及免疫反应[16]。肠屏障按功能特点分为机械、化学、生物及免疫屏障。肠黏膜上皮细胞间的紧密连接是肠上皮细胞间的主要连接方式，属于机械屏障的重要组成部分。Claudin-2作为一种紧密连接蛋白，其表达水平与肠道通透性有关，其表达水平升高提示肠道通透性升高，一定程度上反映肠屏障功能的变化[17]。本实验发现，Claudin-2蛋白在POI小鼠的回肠组织表达明显升高，JNK基因敲除的小鼠未见其增加，这一结果和Al-Sadi等[3]的研究相符。这可能是由于POI的小肠炎症介质水平升高，肠黏膜受损，肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白进行重新分配，Claudin-2蛋白表达升高，肠道通透性增加。JNK敲除后减少炎症介质释放，干扰Claudin-2蛋白表达。

本实验发现，POI造模后，小肠运动功能减弱，回肠光镜下表现为肠黏膜轻度损伤及炎性改变，回肠炎症介质MPO、IL-1β和IL-6水平的明显升高；JNK基因敲除后，小肠运动能力有所改善，回肠病变减轻，炎症介质水平明显下降，提示JNK基因敲除可以减轻POI时肠道的病理变化，从而提示： JNK信号通路参与POI炎症反应，JNK基因敲除后该通路受到抑制，干扰了相关的炎症级联反应，使肠道组织损伤减轻，肠道运动功能得到改善。此外，JNK信号通路对细胞凋亡有调控作用[18]，本实验发现JNK基因敲除小鼠在POI时肠黏膜损伤程度减轻，可能与其促进肠上皮细胞凋亡能力减弱也有关系。

综上，JNK基因敲除能缓解或改善POI小肠的运动功能以及组织的炎症病理变化，提示JNK信号通路通过参与炎症反应，在POI发病机制中起着一定的作用。