芹菜根中一种具有抗癌活性的双氨基甲酸酯

杨晓军，高 霞，赵 敏，李文惠，张越诚，汤江江

1延安大学化学与化工学院；2延安大学附属医院，延安 716000；3西北农林科技大学，杨凌 712100

芹菜ApiumL.为伞形科植物，是食药同源品种，全世界各地均有栽培[1]。芹菜中富含有黄酮、氨基酸、香豆素等多种物质[2]，具有抗菌、抗肿瘤和抗心血管等疾病的作用[3，4]。目前对芹菜化学成分的研究主要集中在其茎、叶和籽上，对其根部化学成分的研究较少。为挖掘芹菜根中的抗肿瘤活性成分。本实验通过采用多种色谱分离技术，对陕西蒲城县种植的旱芹根乙醇提取物进行了分离纯化，得到3个单体化合物，利用其光谱数据及其文献比对法确定3个单体化合物的结构分别为：双氨基甲酸酯AG-01 (1)、佛手柑内酯 (2)和芹菜素 (3)。同时采用MTT法对化合物1进行了体外抗肿瘤细胞实验，结果表明化合物1对肝癌细胞BEL-7402和胃癌细胞SGC7901均具有较好的细胞毒活性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

X-4型显微熔点仪(上海科学仪器有限公司)；IR Prestige-21红外光谱仪(日本岛津公司) ；AV-500 型核磁共振仪 (瑞士Bruker公司)，TMS为内标；MAT-711型质谱仪(美国Thermo公司)； Vario EL 有机元素分析仪(德国Elementar公司)； JP600型超声波提取器(武汉嘉鹏电子有限公司)。

1.2 材料

Sephadex LH-20(Pharmacia产品)；柱层析色谱和薄层色谱用硅胶(青岛海洋化工厂产品)；四甲基偶氮唑盐溶液(MTT)试剂(Sigma公司)；阳性对照品紫杉醇(紫杉醇江苏红豆杉药业有限公司)；人肝癌细胞株BEL-7402(上海美轩生物科技有限公司)、人肺癌细胞株A549(上海继和生物科技有限公司)，人胃癌细胞株SGC-7901(上海研生生化试剂有限公司)；旱芹根于2017年11月采集自陕西省蒲城县，经延安大学生命科学院白重炎研究员鉴定为伞形科芹属ApiumL.的根，标本存放于延安大学天然产物化学实验室,标本编号为YD20171109。

2 实验方法

2.1 提取和分离

称取芹菜根2.0 kg(干重)，用粉碎机粉碎成粉末，将此粉末在超声波辅助提取下，用50%的乙醇提取3次，每次1 h，将所得提取液减压浓缩后得黄色浸膏，将此浸膏混悬于水中后，用石油醚萃取，将石油醚萃取液减压浓缩后得石油醚萃取物21 g。将此萃取物首先经硅胶柱层析分离，以氯仿-丙酮梯度洗脱(100∶0→1∶1)，洗脱馏分根据薄层板点板情况进行合并，共分得3段(P1-3)。第1段硅胶柱色谱(石油醚∶氯仿=20∶1)分得化合物1(13 mg)。第2段硅胶柱色谱(石油醚∶氯仿=15∶1)，再根据薄层板点板情况合并相同部分，将此合并部分再经Sephadex LH-20纯化得化合物2(105 mg)。第3段硅胶柱色谱(石油醚∶氯仿=9∶1)分得化合物3(51mg)。

2.2 化合物1的体外细胞毒活性

采用MTT法对化合物1进行体外细胞毒活性测定。取处于对数生长期的3株人体肿瘤细胞(人肝癌细胞BEL-7402、人肺癌细胞A549和人胃癌细胞SGC-7901)，用含10%小牛血清的 RPMI 1640 细胞培养液调整细胞浓度，以3 000～4 000个/孔接种于96孔板上，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培育24 h后加药。设阴性对照组(DMSO溶剂对照组)、阳性对照组(紫杉醇)和化合物1实验组，每组设立3个复孔，受试化合物1的终浓度分别为75.83、37.91、18.96、9.48、4.74 μM，培育48 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(0.012M)，继续孵育反应4 h，弃去上清液，加入DMSO 100 μL /孔，振荡均匀后用酶标仪在570 nm处测定每孔光密度值(OD值)，计算对细胞增殖抑制率，并用Origin7.0软件计算其 IC50值。细胞增殖抑制率(%)=[(对照组OD平均值-给药组OD平均值)÷对照组OD平均值]×100%

3 结果与分析

3.1 结构鉴定

化合物1浅灰色粉末固体(丙酮)，mp.222.1～223.4 ℃；与三氯化铁反应呈阳性，提示含有酚羟基；HR-ESI-MS:m/z221.1431[M]+(C10H7NO5，计算值221.142 3)，确定相对分子质量为221，不饱和度为8。IR (KBr) νmax3 327～3 485 cm-1(酚OH)，3 014 cm-1苯环C-H伸缩振动吸收峰，1 683 cm-1(酰胺羰基C=O伸缩振动吸收峰)、2 962 cm-1和 2 835cm-1处有强吸收峰为亚甲基C-H不对称伸缩振动和对称伸缩振动吸收峰，1 604、1 576、1 492 cm-1为苯环的骨架伸缩振动吸收峰；13C NMR(125 MHz,CDCl3)共显示6条谱线，DEPT谱显示有1条芳香次甲基碳信号δc：110.6 (d)，1条sp3杂化亚甲基碳信号δc：67.8(t)，4条季碳信号δc：165.8(s，酰胺C=O),145.3(s,芳香季碳)，130.1(s,芳香季碳)，154.6(s，连接氧原子芳香季碳)；1H NMR(500 MHz,CDCl3)共显示有3种类型氢，由各类型氢的积分面积和分子式可以确定该化合物为一对称分子，δH：6.76(2H,s,2个芳香CH)，5.19(4H,s,2个sp3杂化-CH2),9.51(1H,br s,-OH)；在HMBC相关谱图中观察到δ：5.19的亚甲基氢分别与酰胺羰基季碳δc：165.8、芳香季碳δc：130.1以及芳香次甲基δc：110.6相关。该化合物的其它C-H相关及其所有1H NMR和13C NMR数据见表1所示。综合以上的分析化合物1可被推定为一新的双氨基甲酸酯化合物。

化合物2白色针晶(甲醇)；mp.189.6～190.3 ℃。EI-MS:m/z217[M+H]+,239[M+Na]+，元素分析得知碳、氢的百分含量分别为：66.39和4.11；质谱和元素分析提示该化合物的分子式为C12H8O4。IR (KBr) νmax1 728，1 637，1 612,1 472,1 408 cm-1；1H NMR (CDC13,500 MHz)δ: 6.31(1H,d,J=8.8 Hz,H-3),8.06(1H,d,J=8.8 Hz,H-4)，7.14(1H,s,H-8),7.58(1H,d,J=8.6 Hz,H-12),6.97 (1H,d,J=8.6 Hz,0.8 Hz,H-13)，4.46 (3H,s,5-OCH3);13C NMR(CDCl3,125 MHz)δ: 164.2 (C-2)，113.2 (C-3),139.6(C-4),151.2 (C-5),112.9(C-6),156.3(C-7),94.7(C-8),153.3(C-9),105.8(C-10),144.6(C-12),106.2(C-13),61.7(5-OCH3)。以上数据与文献[5，6]对照，确定该化合物为佛手柑内酯。

图1 化合物1的主要HMBC相关Fig.1 The key HMBC of compound 1

PositionδH(mult.,JHH Hz)δc1H-1HCOSYHMBC1154.6 (s)2,66.76 (CH,s)110.6 (d)C-7,C-43,5145.3 (s)4130.1 (s)7,7`5.19 (s)67.8 (t)C-2,C-4,C-8,8`8,8`165.8 (s)1-OH9.51 (br s)

化合物3浅黄色针状结晶(甲醇)；1H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ:6.83 (1H,s,H-3),6.24(1H ,s,H-6),6.52(1H,s,H-8),7.79(2H,d,J= 8.6，H-2′,6′),6.91(2H,d,J= 8.6 Hz,H-3′,5′),12.04(1H,br.s,5-OH),10.67(1H,br.s,7-OH),10.43(1H,br.s,4′-OH)；13C NMR (125 MHz,DMSO-d6) δ:164.8(C-2),104.7(C-3),181.9(C-4),161.3(C-5),98.7(C-6),165.1(C-7),94.1(C-8),161.7(C-9),102.9(C-10),121.5(C-1′),128.6(C-2′,6′),117.1 (C-3′,5′),157.6(C-4′)。以上数据与文献[7,8]对照，确定该化合物为芹菜素。

3.2 化合物1的体外细胞毒活性

采用MTT法对化合物1进行体外细胞毒活性测试，结果表明化合物1对人胃癌细胞SGC-7901和人肝癌细胞BEL-7402均具有较强的细胞毒活性，具体活性结果见2。

表2 化合物1的细胞毒活性

4 结论

目前从芹菜根中分离得到具有较强抑制肿瘤细胞生长的化学成分主要为芹菜素和佛手柑内酯[9,10]。本文首次报道从陕西产旱芹根中分离得到一个新的双氨基甲酸酯化合物，并研究了该化合物对人体肿瘤细胞的体外毒活性，研究表明该化合物对人胃癌细胞SGC-7901和人肝癌细胞BEL-7402具有较强的细胞毒活性，IC50分别为29.6和32.4μM。这一研究结果为进一步对陕西产旱芹根的开发利用提供了科学依据。