激流灌注式生物反应器培养猪瘟活疫苗工艺的研究

2016-03-25郑朝朝柳珊邹立宏刘云涛刘涛郁宏伟

中国动物保健 2016年2期

关键词：猪瘟

郑朝朝柳珊邹立宏刘云涛刘涛郁宏伟

摘要：为建立规模化培养猪瘟活疫苗的生产工艺，本研究利用工作体积为10L的激流灌注式生物反应器培养猪睾丸细胞（swine testis，ST），接种猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）进行培养研究。研究结果显示，培养4d细胞数可增长5-7倍，接种病毒后15d可收获毒液6次，收获量至少与200个10L转瓶单次收获量相当，产品各项检测均合格。本工艺极大地缩短了培养时间，为规模化培养工艺的推广与使用提供了技术参数。

关键词：猪瘟；脾毒；细胞毒；激流灌注式生物反应器

猪瘟是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的猪的一种热性、急性、接触性传染病。此病于1833年首先在美国等地发现，以后遍及世界各大洲，发病率和死亡率高，危害极大。猪瘟的治疗无特效药物，最有效的方法就是疫苗的免疫接种，因此疫苗免疫效果的优劣对猪瘟防控起了决定性作用。2007年9月，猪瘟兔化弱毒脾淋疫苗被农业部定为政府采购推广应用的首选疫苗。

本研究中应用激流灌注式生物反应器（工作体积为10L）对猪瘟病毒的培养工艺进行了初步探索：以第一代细胞毒做为毒种，培养15d可收获毒液6次，各收次病毒液效价均可达到1.0×lO⁶RID/mL以上，病毒收获量至少与200个10L转瓶的单次收获量相当，且各种检测均符合规程要求。该工艺与原有的转瓶生产工艺相比，培养时间缩短一半，产品质量稳定，效价高。该工艺的建立为规模化培养工艺的推广与使用提供了技术参数。

1 材料和方法

1.1 细胞、病毒及实验动物

猪睾丸细胞（ST）购自广东永顺生物制药股份有限公司；猪瘟病毒兔化弱毒株脾毒（CSFV）由瑞普（保定）生物药业有限公司种毒室提供；安全检验用猪瘟抗体阴性猪购自河北唐县某猪场；效力检验用家兔购自河北定州某兔场。

1.2 主要试剂、设备

高糖DMEM培养基购自GJIBCO公司；葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司；猪瘟专用新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司；胰蛋白酶购自GIBCO公司；猪瘟抗原检测试剂盒购自爱德士元亨试剂公司。AP20C型激流灌注式多功能生物反应系统购自杭州安普生物工程有限公司（工作容积10L）。

1.3 细胞复苏与培养

以常规方法复苏、传代增殖ST细胞，并检测细胞的单日葡萄糖消耗量。

1.4 毒种的制备

取已形成良好单层的ST细胞，弃去培养液，接种猪瘟脾毒毒种，取二收、三收的毒液做为生产用细胞毒毒种，备用。

1.5 细胞罐体接种与培养

以常规方法消化已长成良好单层的转瓶ST细胞，收集细胞悬液并计数，将细胞接种至生物反应器灌注袋内，接种密度为1.0-2.0×10⁷cells/g。静置吸附1h。吸附过程完成后向反应器系统内加入含8%新生牛血清的DMEM培养基。设定设备参数：T1：37℃、T2：40℃、T3：36℃，pH：7.3 ，D0：50%-70%，振荡速度20r/min，空气流量100mL/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养。

每12h取样一次，用葡萄糖检测试剂盒检测营养液葡萄糖浓度。当残糖浓度低于1g/L时，开始补液或者换液，维持残糖浓度，并根据葡萄糖消耗量，分析细胞生长情况。

1.6 病毒接种、培养与收获

细胞培养至第4d葡萄糖消耗量趋于平稳时，弃去培养液，用不含血清的DMEM液冲洗灌注袋，接种CSFV细胞毒毒种800mL，设定设备参数，T1：36.5℃、T2：40℃、T3：36℃，pH：7.4，D0：50%-70%启动病毒培养程序，进行病毒培养。

自接毒后每8h取样测糖、测效价，接毒24h补充2倍浓缩DMEM液；前3收每48h进行一次收获换液；4-6收每72h进行一次，每次换液后48h补充200g/L的葡萄糖，使残糖浓度维持在1.5g/L。

1.7、半成品检验

无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行。

半成品病毒含量测定用猪瘟抗原检测试剂盒和兔体定型热反应两种方法测定。

1.8 疫苗的制备与检验

1.8.1 疫苗制备

将检验合格的病毒液混合于同一容器，加入牛奶蔗糖冻干保护剂充分摇匀，定量分装，迅速冷冻真空干燥即得成品。

1.8.2 疫苗安全性检验

按瓶签注明头份，将疫苗用生理盐水稀释为每毫升含6头份，肌肉注射CSFV抗体阴性健康猪5头，每头5mL，观察2ld。