基于植物代谢组学方法的马钱子油炸炮制前后化学差异研究

2019-03-08秦伟瀚王云红郭延垒

天然产物研究与开发 2019年2期

秦伟瀚，阳勇，李卿，王云红，花雷，郭延垒

重庆市中药研究院，重庆 400065

马钱子为马钱科植物马钱(Strychnosnux-vomicaL.)或云南马钱(StrychnoswallichianaSteudExDC.)的干燥成熟种子[1-3]。具有散结消肿，通络止痛之功效。中医临床常用于治疗跌打损伤，痈疽肿痛，风湿顽痹，麻木瘫痪等证[4]。油炸马钱始源于明代《鲁府秘方》，清代《良朋汇集》中“用香油炸待浮起，取出，乘热去皮为末”是香油制马钱子的最早记载[5,6]。由于马钱子的剧烈毒性，极大的限制了其临床应用，马钱子通常要经过高温或加热炮制，历代医药文献记载的马钱子多使用炮制品，包括砂烫、油炸、醋制、阳江九制等十多种炮制方法，而今常用的仅砂烫和油炸两种[7,8]。已往研究表明，马钱子受热后，其主要的毒成分士的宁、马钱子碱含量会有所降低，同时生成毒性更低、治疗效果更好的氮氧化物，增强了使用的安全性和有效性[9,10]。目前报道的化学成分研究多以砂烫马钱子和生品为主[11-13]，油炸后马钱子化学成分研究鲜见报道，本研究结合定性、定量分析、OPLS-DA分析，共同探讨马钱子油炸前后的化学变化，为马钱子炮制机理阐释及深入开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

LC-30A型超高效液相色谱仪(日本，岛津公司)：二元高压泵、自动进样器、柱温箱；AB4000三重四级杆串联质谱；Triple TOFTM 4600型四极杆串联飞行时间高分辨质谱仪(美国，AB公司)：Analyst 1.6工作站、PeakView 1.2.0.3 数据处理软件；BJ-100型超高速中药粉碎机(中国，德清拜杰电器有限公司)；PBM-20型球磨仪(中国，长沙中晶化工机械有限公司)；JY92-ⅡD型超声波细胞粉碎机(中国，宁波新艺超声设备有限公司)；CPA225D型十万分之一分析天平(德国，赛多利斯公司)。

马钱子碱(批号：10284-201611)，士的宁(批号：10408-201611)：均由南昌贝塔生物科技有限公司提供。乙腈、水(色谱纯级，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯级，美国ACS公司)；甲醇(分析纯，重庆川东化工公司)；芝麻油( 重庆市巢宁麻油厂)。马钱子样品购于重庆中药材市场(产地：广西省)，经重庆市中药研究院生药研究所刘翔副研究员鉴定为马钱科植物马钱(Strychnosnux-vomicaL.)的干燥成熟种子。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈溶液；梯度程序：0～2.0 min，5%B；2.0～10.0 min，5%～60%B；10.0～16.0 min，60%～80%B；16.0～20.0 min，80%～90%B；20.0～22.0 min，90%～5%B；22.0～25.0 min，5%B；流速：0.2 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：2 μL。

1.2.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源(ESI)，正/负离子模式分别采集，喷雾电压(IS)：+5 500 V、-4 500 V；雾化气压力(GS1)：55 Psi；气帘气压力(CUR)：20 Psi；辅助气压力(GS2)：50 Psi；离子源温度(TEMP)：600 oC；簇裂解电压(DP)：65 V；碰撞能量(CE)：45 V；碰撞能量滚动区间(CES)：15 V；检测模式为IDA(信息关联采集模式)，多重质量亏损(MMDF)和动态背景扣除(DBS)为触发二级的条件，满足该条件优先进行二级扫描。

1.2.3 样品溶液制备

取市售麻油400 mL，倒入铁锅中，用温程400 ℃温度计测温，天然气炉上加热至230 ℃时投入马钱子，炸至老黄色为度，取出沥尽油，晾冷[5,14]。并将上述炮制前后马钱子粉碎后过100目筛，取粉末0.2 g，精密称定，置5 mL试管中，精密加入75%甲醇2 mL，称定重量，于超声波细胞破碎仪中超声处理(功率：600 W)40 min，取出，放冷，再次称定重量，用80%甲醇补足减失重量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

1.2.4 对照品溶液制备

取适量马钱子碱、士的宁标准品于10 mL容量瓶中，加入色谱甲醇溶解定容至刻度，制成浓度为1.0 mg/mL的对照品溶液，备用。

1.2.5 定性分析数据处理方法

查阅马钱子化学相关文献[15,16]，将化合物信息输入PeakView软件，建立马钱子已知成分筛查数据库；采用“样品溶液制备”方法对油炸及生品马钱子样品进行提取，并采用已建立的色谱、质谱条件对该样品数据进行采集。采集完成后，将上述数据导入PeakView软件，利用已建立的筛查数据库将满足质量误差小于5 ppm、同位素分布正确且含有二级碎片的离子作为分析目标化合物，结合软件Formula Finder、Mass Calculators等功能、在线数据库(Human Metabolome Database、Pub Chem、Chemical Book等)及二级碎片裂解规律，对马钱子炮制前后样品进行快速的定性鉴别分析。

1.2.6 OPLS-DA分析数据处理方法

按照上述炮制方法制备油炸马钱子样品，并采用已建立的色谱质谱条件进行数据采集；将高分辨质谱采集到的数据导入Notepad软件，该软件会自动将离子精确质荷比、保留时间、强度等信息提取出来，并对每个离子进行编号；再将Notepad软件提取的数据代入SIMCA-P 14.1软件进行OPLS-DA拟合，得到Scatter得分图及S-plot图，最终将分析结果代入PeakView软件对炮制前后差异性生物标志物进行定性分析鉴定。

1.2.7 Q-TOF定量处理方法

马钱子碱母离子提取范围395.18～395.20，定量离子提取范围324.12～324.13，定性离子提取范围244.09～244.10；士的宁母离子提取范围335.16～335.18，定量离子提取范围184.07～184.08，定性离子提取范围264.10～264.11。

2 结果与讨论

2.1 油炸及生品马钱子定性分析

查阅文献，建立马钱子已知化学成分筛查数据库,对油炸及生品马钱子样品进行提取，Q-TOF质谱进行数据采集(TIC重叠图见图1)。采用PeakView软件结合在线数据库、二级碎片裂解规律进行定性分析。据文献统计，马钱子已报道成分超过60个，本实验从油炸及生品马钱子的醇提样品中共找到30个化合物(表1)，检出率为50%，并发现一个新成分，主要包括生物碱类、糖苷类、脂肪酸酯类、醇类等；检出个数最多的化合物种类为生物碱类，共12个；以往研究认为生物碱是马钱子的主要功效成分，亦是毒性成分，油炸法是通过高温降低马钱子碱和士的宁的含量，从而降低了毒性；同时马钱子碱和士的宁会转化为氮氧化物，而氮氧化物的毒性远低于两种原型，治疗效果却比原型要高，本实验仅检测出了马钱子碱氮氧化物。番木鳖次碱和马钱素仅在生品中检测到，而仅在油炸品中找到的成分为阿魏酸和羽扇豆醇，可能与高温炮制过程等因素相关。

图1 油炸品与生品总离子流重叠图Fig.1 Overlapping chart of total ions chromatogram of fried product and raw product注：(a)正离子模式下油炸品和生品的总离子流重叠图、(b)负离子模式下油炸品和生品的总离子流重叠图。Note:(a)Tic overlap map in positive ion mode,(b)tic overlap map in negative ion mode.

续表1(Continued Tab.1)

保留时间tR(min)离子峰归属Ion mode质荷比Mass charge ratio(m/z)实测值Measured mass理论值Calculated mass二级碎片离子MS/MS fragment ion偏差Deviation(ppm)分子式Formula鉴定结果Identification results4.70[M+H]+268.103 8268.104 0136.060 7,119.034 8-1.0C10H13N5O4腺苷Adenosine4.70[M-H]-193.049 9193.050 6175.038 8-3.6C10H10O4阿魏酸●Ferulic acid4.83[M-H]-375.129 2375.129 7213.076 2-1.3C16H24O10番木鳖苷酸Loganic acid5.05[M-H]-299.112 8299.113 6137.057 0,119.034 1-2.6C14H20O7毛柳苷Salidroside5.32[M-H]-137.024 1137.024 492.027 0-2.4C7H6O3水杨酸Hydroxybenzoic acid5.41[M-H]-109.029 5109.029 591.019 5-0.3C6H6O2儿茶酚Catechol5.53[M+H]+355.102 3355.102 4163.038 4,145.027 5-0.2C16H18O9绿原酸Chlorogenic acid5.53[M-H]-153.018 8153.019 3125.023 7-3.2C7H6O4原儿茶酸Protocatechuic acid5.70[M+H]+353.185 5353.186 0335.173 1-1.4C21H24N2O3异伪番木鳖碱 Isopseudostrychnine5.70[M-H]-151.039 6151.040 1136.016 3-3.3C8H8O3对羟基苯乙酸 Hydroxyphenylacetic acid5.64[M+H]+335.174 7335.175 4307.143 3-2.0C21H22N2O2士的宁Strychnine5.73[M+H]+395.195 6395.196 5379.163 8-2.2C23H26N2O4马钱子碱Brucine5.74[M+H]+425.205 9425.207 1368.147 3-2.8C24H28N2O5诺法生Novacine5.77[M+H]+391.159 7391.159 8229.108 0-0.3C17H26O10马钱素▲Loganin5.87[M+H]+411.189 9411.191 5394.186 5,379.163 2-3.8C23H26N2O5马钱子碱N-氧化物Brucine N-oxide5.94[M+H]+351.168 7351.170 3334.166 4,333.158 4-4.7C21H22N2O34-羟基番木鳖碱 4-Hydroxystrychnine5.96[M+H]+365.185 1365.186 0308.126 5-2.4C22H24N2O3可鲁勃林Colubrine6.16[M+H]+381.179 3381.180 9364.175 9-4.2C22H24N2O42-羟基-3-甲氧基番木鳖碱 2-Hydroxy-3-methoxystrychnine6.23[M-H]-167.034 9167.035 0151.002 6-0.6C8H8O4香草酸Vanillic acid6.32[M-H]-207.065 9207.066 3189.053 6,162.030 7-1.9C11H12O4咖啡酸乙酯Ethyl caffeate6.90[M+H]+557.258 2557.256 6395.196 82.8C21H24N2O番木鳖次碱▲Vomicine7.03[M+H]+405.140 1405.139 1387.136 42.4C17H24O11断氧化马钱子苷Secoxyloganin7.41[M+H]+365.149 2365.149 6347.137 2-1.0C21H20N2O418-O-伪马钱子碱 5-Oxopseudostrychnine8.24[M+H]+409.176 0409.175 8381.143 60.5C23H24N2O58-O-马钱子碱5-Oxobrucine15.96[M+H]+457.367 9457.367 6411.366 90.8C30H48O3熊果酸Ursolic acid19.26[M-H]-425.363 2425.363 6407.354 4,363.360 4-1.1C26H50O422-[(2-Methyl-2-propanyl)oxy]-22-oxodocosanoic acid★20.80[M+H]+425.377 4425.377 8407.361 8-1.0C30H48O5,6-羊齿烯醇Simiarenol20.90[M+H]+427.391 8427.393 4409.378 2-3.7C30H50O羽扇豆醇●Lupeol

注：●仅油炸中含有，▲仅生品中含有，★未报道成分。

Note:●Only fried product contain,▲only raw product contain,★new chemical constituents.

2.2 OPLS-DA分析

将高分辨质谱检测的数据结果导入SIMCA-P软件(版本号：14.1)，建立正交偏最小二乘数学模型；通过OPLS-DA分析共找到17个差异性生物标志物，包括生物碱类(7个)、糖苷类(4个)、有机酸类(5个)，其中12个成分为马钱子文献首次报道；分析结果(表2)显示在正离子模式下找到7个生物碱和1个二糖，在负离子模式下找到3个糖苷和5个有机酸；由得分图(图2)可知，油炸品和生品数据点区分明显，表明马钱子经过油炸炮制后，化学成分有了显著变化。士的宁、麦芽糖、Dattelic acid和油酸分别位于正、负离子下S-plot图的两端，说明经过油炸炮制后这四种化合物变化是最为显著；有报道称士的宁的毒性是马钱子碱的20倍，而在S-plot图(图3)中士的宁数据点明显比马钱子碱离轴更远，可以间接证实油炸炮制的减毒效果。生物碱是马钱子药理、毒理研究的重点和热点，在正离子模式下，炮制品与生品共找到7个生物碱类差异性标志物，证明油炸炮制能有效降低生物碱含量，从而降低毒性。负离子模式下，找到5个有机酸类化合物，其中油酸广泛存在于动植物体内，被OPLS-DA识别出来，可能与该类化合物的高温分解有关；应该是造成其油炸炮制前后显著差异的原因。生物标志物的二级及裂解规律图见图4。

图2 油炸品与生品OPLS-DA得分图Fig.2 Score scatter plot of fried product and raw product注：(a)正离子模式下得分图、(b)负离子模式下得分图。Note:(a)Score scatter plot in positive ion mode、(b)Score scatter plot in negative ion mode.

图3 油炸品与生品的S-plot图Fig.3 S-plot chart of fried product and raw product注：(a)正离子模式下S-plot图、(b)负离子模式下S-plot图。Note：(a)S-plot in positive ion mode、(b)S-plot in negative ion mode.

ID号No.保留时间tR(min)离子归属Ion mode质荷比Mass charge ratio(m/z)实测值Measured mass理论值Calculated mass误差Deviation(ppm)分子式Formula鉴定结果Identification results油炸品平均强度Intensity of fried product(psi)生品平均强度Intensity of raw product(psi)M11.19[M-H]-191.055 0191.054 90.3C7H12O6奎尼酸★Quinic acid94 66631 904M21.19[M-H]-387.111 2387.111 3-0.3C13H24O137-(α-D-Glucopyranosyloxy)-2,3,4,5,6-pentahydroxyheptanoic acid★13 997147 369M31.22[M+Na]+365.104 8365.105 1-0.8C12H22O11麦芽糖★Maltose64 574248 589M44.70[M-H]-315.069 5315.069 7-0.5C13H16O9b-D-Glucopyranose,1-(2,5-dihydroxybenzoate)★48 441289 948M54.93[M-H]-375.127 0375.126 51.3C16H24O10番木鳖苷酸Loganic acid391 668739 924M65.30[2M-H]-707.179 9707.179 9-0.1C16H18O9Isobiflorin★63 026183 285M75.55[M+H]+349.190 3349.190 20.2C22H24N2O2甲基士的宁★Methyl strychnine1 076 893411 424M85.61[M+H]+335.174 8335.174 70.3C21H22N2O2士的宁Strychnine4 127 4283 096 904M95.70[M+H]+395.195 6395.195 7-0.4C23H26N2O4马钱子碱Brucine2 820 6592 286 980M105.86[M+H]+411.190 6411.191 6-2.5C23H26N2O5马钱子碱N-氧化物Brucine N-oxide124 531227 983M116.13[M+H]+381.180 5381.180 7-0.6C22H24N2O42-羟基-3-甲氧基番木鳖碱 2-Hydroxy-3-methoxystrychnine389 5791 446 089M126.26[M-H]-335.074 4335.074 5-0.4C16H16O8Dattelic acid★67 5462 754M136.28[M+H]+503.216 9503.217 0-0.1C29H30N2O6Methyl-4-({(2E)-3-(3,4-diethoxyphenyl)-2-[(2-methylbenzoyl)amino]-2-propenoyl}amino)benzoate★31 956313 045M146.37[M+H]+443.196 0443.196 2-0.4C27H26N2O41-(4-Biphenylylcarbonyl)-N-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-4-piperidinecarboxamide★145 304521 859M1516.27[M-H]-279.230 6279.230 8-0.6C18H32O2Dihomolinoleic acid★12 815282 776M1617.35[M-H]-281.246 4281.246 7-1.0C18H34O2油酸★Oleic acid147 2501 769 543M1718.91[M-H]-383.350 6383.350 40.5C24H48O32-羟基二十四烷酸★Cerebronic acid1 94789 797

注：★未报道成分。

Note:★New chemical constituents.

2.3 主要化学成分含量分析

采用UPLC-Q-TOF-MS对油炸品、生品马钱子中马钱子碱、士的宁含量进行检测，马钱子碱进样浓度在0.099～990 ng/mL范围与峰面积线性关系良好，线性回归方程为Y=393.143 47X+5 044.336 72，r=0.999 4；士的宁进样浓度在0.11～1 100 ng/mL范围内与峰面积线性关系良好，线性回归方程为Y=360.336 74X+6 145.348 92，r=0.999 5；马钱子碱在油炸、生品中平均含量分别为1.14%、1.22%，士的宁在油炸、生品中平均含量分别为1.29%、1.55%。生物碱是马钱子研究的重点和热点，士的宁和马钱子碱占总碱的80%以上，一般认为马钱子碱和士的宁既是主要毒性成分又是主要的药效成分，由于两种物质的治疗窗口和毒性窗口十分接近，所以在用药之前大多会采取炮制以降低其毒性。通过相关专家及实验结果鉴定本研究采用的马钱子为《中国药典》规定品种，通过比较相关检测文献，其士的宁、马钱子碱的含量与实验结果接近，证明药材鉴定结果准确、可靠。本研究采用的炮制方法为油炸法，是马钱子的主要炮制方法。由定量检测结果可以看出经过油炸炮制后士的宁和马钱子碱含量都有不同程度降低，但仍符合标准(士的宁应为1.20%～2.20%，马钱子碱不得少于0.80%)的要求，上述结论与OPLS-DA分析探讨结果一致。经文献证实，士的宁毒性是马钱子碱的20倍，定量结果显示，经油炸炮制之后，士的宁含量下降程度要高于马钱子碱，证明油炸炮制减毒效果尚佳。

图4 差异性化合物的裂解规律图Fig.4 The possible fragmentation pathway of differential compounds

3 结论

马钱子化学成分复杂，据报道该药材生物碱占总成分的2%～5%，是研究的重点和热点，其中士的宁和马钱子碱占总碱的80%以上，是主要的毒性成分和功效成分[17,18]；油炸法早在明代就被《鲁府秘方》所收载，是至今为止马钱子沿用最为广泛的炮制方法。以上研究结果表明炮制前后差异最显著的成分是生物碱类(7个)和有机酸类(5个)，可能与这两类化合物在高温下容易被氧化分解相关；结合定性、定量分析结果可知，马钱子碱和士的宁是差异显著成分之一，在炮制前后含量有不同程度降低，但仍能达到药典规定。说明在油炸炮制过程中不仅降低了毒性，同时还保留了一定药效。本研究结果对马钱子炮制机理阐释具有重要意义，同时也为该药材的药效物质基础阐明提供科学依据。