冠心病患者外周血中lncRNA-ANRIL的表达水平及其临床意义

王 娜 ，张学军

（1.天津医科大学免疫学系,天津300070；2.天津市滨海新区大港医院检验科,天津300100）

冠心病引起的心肌梗死等卒中性疾病目前依然是全球人口死亡和残疾的主要原因[1-2]。尽管目前心血管介入治疗技术发展迅速，但仍有相当大比例的冠心病患者在早期未能准确诊断，并且在心梗发作时不能得到有效的救治，急性冠脉综合征等冠心病严重阶段将会对心肌细胞造成严重损害，最终导致心肌细胞坏死、凋亡、肥大或纤维化。目前研究发现冠心病所致心肌损伤的一部分机制是通过基因表达的下调而诱导的，非编码RNAs被任意分为短非编码RNAs(microRNA，20~22个核苷酸长)和长非编码 RNAs(lncRNAs，200 个核苷酸)。miRNAs主要通过调节靶信使RNA的功能来下调基因表达[3]，但lncRNAs对基因表达的调控更为复杂，包括激活或抑制基因表达、调节染色质结构等[4]。目前多项研究报道lncRNA已经成为肿瘤学领域中进行诊断的新的生物标志物以及肿瘤治疗的新靶点[4-5]，然而，笔者对lncRNAs在心血管疾病中的作用认识还处于初步阶段，本研究主要探索了lncRNA-ANRIL于冠心病病人外周血清中的表达及其诊断意义，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年2月-2018年2月来自天津市大港医院行冠状动脉CT造影或冠脉CT的患者231例，定义为冠心病组，男性189例，女性42例，平均年龄（63.42±10.75）岁；同时选取健康志愿者447例，定义为对照组，男性359例，女性88例，平均年龄（61.17±9.84）岁。冠心病组纳入标准：冠脉CT造影检查：右冠状动脉、左回旋支、左前降支、左主干的主要血管，根据Judkins标准：每个血管进行至少3个多体位头测定，结果示≥1支血管直径出现超过50%的狭窄确诊为冠状动脉粥样硬化性心脏病。排除标准：伴有严重肝肾功能不全、周围血管性疾病、肿瘤、血液系统疾病、急慢性感染性疾病、慢性阻塞性肺疾病、心律失常、瓣膜性心脏病等。

1.2 主要实验试剂 Trizol试剂购自invitrogen公司，根据图1 9p21区域基因转录图谱，选择lnc RNA-ANRIL、CDKN2A、CDKN2B、GAPDH 基 因 作为引物合成对象，上下游引物由武汉金凯瑞公司合成。SYBR GREEN Master Mix与逆转录试剂盒均购自赛默飞世尔公司。

图1 9p21区域基因转录图谱Fig 1 9p21 regional gene transcription map

1.3 血液样品采集 抽取两组患者晨起空腹肘静脉血7 mL于EDTA抗凝管中，控温离心机4℃，3000 r/min离心血液样本15min，取上层清液即血清进行后续实验测定。本实验经过医院伦理委员会讨论通过，受试者均签署知情同意书。

1.4 血清总RNA提取及cDNA第一链合成 取100 μL 血清，加入 900 μL Trizol，于室温下充分混匀15 min，加入 200 μL 氯仿，剧烈震荡 15 s，室温下静置后4℃，12 000 r/min离心15 min，取上层清液450 μL，加入 450 μL丙二醇，轻柔颠倒混匀后再次相同条件离心15 min，此时可见RNA白色沉淀，75%乙醇润洗两次后DEPC水溶解，调节各样品RNA浓度均在1 000 ng/μL之内，按照逆转录试剂盒说明：各样品均取 1μgRNA，1μLoligo（dt）（5 μg/μL）,补 DEPC水至12 μL，65℃反应5 min后迅速至冰上，加入 5×buffer 4 μL，RNase 抑制剂（20 U/μL）1 μL，RT 1 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，42 ℃孵育1 h，70℃孵育5 min后冰上冷却即完成逆转录。

1.5 RT-PCR法测定外周血中ANRIL等相关指标的表达情况 通过Genebank中的ANRIL、CDKN2A、CDKN2B、GAPDH的序列，使用primer 6.0软件设计引物，ANRIL外显子 1-2上游引物序列为：GCGCTGCCGGAGCTG,下游引物：CAGCATGGACA CCAATATTCTCTC，MGB 探针：CCGGACTAGGACT ATT。外显子17-18上游引物：GCAATTCCAGTGCA AGTATGGTC，下游引物：CCACAATGTTCAACTTGCTGT，MGB 探 针 ：TGATCCAGT AGTATCTTAC。 其 中CDKN2A基因第一外显子引物为上游5′-ACC CTG TCC CTC AAA TCC TC-3′，下游 5′-TGG CTC CTC ATT CCT CTT CCT T-3′；第二外显子引物为上游5′-CAT CTA TGC GGG CAT GGT TA-3′，下游 5′-TGC AGC ACC ACC AGC GTG TC-3′；内对照 β-珠蛋白为上游 5′-CGG GAA ATC GTG CGGAC-3′，下游5′-TCG CTC CAA CCG ACT GCT-3′。CDKN2B 基因上游 5′-CTATGTTTGAATAATTCCAG-3′，下游基因5′-CGCGTCGCCGCGUUAAGAAC-3′。建立10μL反应体系：2×SYBR GREEN Master Mix 5 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 1 μL。RTPCR 反应设置为：95℃反应30 s，35个循环设定：95℃ 10 s、60℃30 s。通过循环数2△△ct法计算血清中各指标的表达情况。

1.6 SNP检测9p21基因区域3种单核苷酸多态性 正常及对照病人的血液样本，提取其基因组DNA，利用Illumina Gold-en Gate技术和Bead Studio软件包进行SNP分型，所有SNP基因型测序准确率为98%。

1.7 统计学分析 通过SPSS18.0软件对实验数据进行分析，计数资料采用χ2检验，计量资料以±s表示，两两比较采用组间t检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 lnc RNA-ANRIL表达与冠心病相关性比较分析 冠心病组 ANRIL（外显子1-2）与 ANRIL（外显子17-18）的相对表达量均明显小于对照组（均P＜0.01），见表1。通过ROC曲线可知ANRIL（外显子1-2）对于诊断冠心病具有显著统计学意义（P＜0.001），曲线下面积为 0.894（95%CI 0.835~0.953），最佳临界值（cut off值）为：0.945 0，敏感性为：50.88%，特异度为98.25%。ANRIL（外显子17-18）对于诊断冠心病也具有显著统计学意义（P＜0.001），曲线下面积为 0.793（95%CI 0.711~0.875）,最佳临界值（cut off值）为1.10，敏感性为45.61%，特异度为94.74%，见图2。

表1 两组lnc-ANRIL相对表达量比较Tab 1 Comparison of relative expression of lnc-ANRIL between the two groups

图2ANRIL诊断冠心病ROC曲线分析Fig 2 ROC curve analysis of the diagnosis of coronary heart disease by ANRIL

2.2 9p21区域单核苷酸多态性与冠心病相关性比较分析 对冠心病组及对照组测定了9p21基因区域 3 种单核苷酸：rs1333049、rs564398、rs2811712 的多态性分布情况。结果显示：rs1333049等位基因频率在两组受试者中具有显著差异（P＜0.05），其中冠心病组等位基因G显著低于对照组（P＜0.05），而rs564398与rs2811712等位基因频率在两组间的比较并无统计学意义（P＞0.05），见表 2，图 3。

2.3 rs1333049等位基因频率G与lnc-ANRIL表达的相关性分析 分别测定了冠心病组rs133049等位基因G的分布与ANRIL（外显子1-2）、ANRIL（外显子17-18）的相关性，发现两者均呈正相关（r=0.340 2/0.312 4，均 P＜0.05），见图 4。

表2 两组单核苷酸等位基因频率比较Tab 2 Comparison of rs1333049 single nucleotide allele frequencies between the two groups

图3 两组rs1333049基因型人数频率比较Fig 3 Frequency comparison of rs1333049 genotypes in the groups

图4 rs1333049等位基因G与ANRIL相关性分析Fig 4 Correlation analysis of rs1333049 allele G and ANRIL

2.4 lnc RNA-ANRIL表达与 CDKN2A、CDKN2B表达的相关性分析 分别测定了冠心病组lnc-RNA表达与CDKN2A、CDKN2B表达的相关性，结果示：lnc RNA-ANRIL（外显子1-2）与CDKN2A、CDKN2B表达均呈正相关（均 P＜0.05），lncRNAANRIL（外显子17-18）与CDKN2A的表达呈正相关（P＜0.0001），而与CDKN2B的表达无相关性（图5）。

图5 ANRIL与CDKN2A、CDKN2B表达的相关性分析Fig 5 The correlation analysis of the expressions of ANRIL,CDKN2A and CDKN2B

3 讨论

本研究主要探索了lncRNA-ANRIL于冠心病病人中的表达及其临床意义，lncRNA-ANRIL属于长链非编码RNA，既往研究将lncRNA-ANRIL鉴定为与多种疾病相关的遗传易感性位点，这些疾病包括2型糖尿病、颅内动脉瘤及多种癌症[6]。lncRNA ANRIL基因位于染色体9p21区域，全长3.8 kb，在人体内多种正常组织中均有表达。ANRIL基因序列的最后一个外显子与9p21心血管疾病相关基因位点相邻，因此我们同时分析了9p21基因区域单核苷酸的表达与之相关性。本研究涉及的另外两个指标：CDKN2A和CDKN2B（编码p15KIK4B，P16UK4A和p14ARF）为两个细胞周期依赖性激酶抑制剂，位于lnc-RNA ANRIL关联点附近，该两种激酶抑制剂均在细胞增殖中发挥了关键作用，并且在该过程中可有效吸附其它激酶。在细胞生长过程中，CDKN2A/B被多梳蛋白所抑制，于细胞生长过程中出现激活[7]。

目前有证据表明ANRIL可通过组蛋白修饰调节CDKN2A/B基因表达的作用。ANRIL可通过调节CDKN2A从而发挥调节细胞衰老的作用，并且表现出衰老依赖的增殖作用[8]。ANRIL转录后可与Chrimbox 7（CBX7亚基的多梳抑制复合物1）整合从而沉默p16INK4A(CDKN2A)，并且可吸附多克隆抑制复合物 2（PRC2）从而沉默 p15INKB（CDKN2B）的表达[9]。此外，ANRIL是CDKN2B基因的反义物，对于CDKN2B有义序列的表达具有抑制作用。因此，在基因敲除ANRIL的情况下，CDKN2B位点的抑制将被削弱，CDKN2B将出现上调[10]。笔者的研究发现ANRIL的减少与增多与CDKN2A表达呈正相关，PR复合假说并不能解释该种机制，这种减少似乎是由另一种机制所引起的。尽管目前的研究报道了ANRIL可通过多梳蛋白抑制CDKN2A/B基因座中的作用，但是ANRIL的每个剪接变体的具体作用以及转录物的所有可能功能仍然缺乏相应的研究。因此本实验分别探讨了ANRIL（外显子1-2）、ANRIL（外显子17-18）对于CDKN2A/B表达的相关性。

染色体9p21区域中与疾病相关的单核苷酸表达极为丰富，与该位点相关的一些基因表型与动脉粥样硬化性疾病、心肌梗死、颅内动脉瘤和2型糖尿病有关[11-14]。此外，与其它远缘病因的疾病，如黑素瘤、皮肤痣、白血病、牙周炎和阿尔茨海默病、子宫内膜异位症和青光眼均有关联[15-19]。全基因组关联研究（GWAS）目前也已经确定了染色体9p21位点基因的遗传变异与心血管疾病的发生具有关联性[20]。因此本研究测定了冠心病组及对照组9p21基因 区 域 3 种 单 核 苷 酸 ：rs1333049、rs564398、rs2811712的表达情况，该3种SNPs均在其它疾病中具有差异性的表达，分析了其不同基因型在冠心病病人中的差异性表达。

通过本次研究笔者发现：SNP rs1333049不同基因型的表达在冠心病人群与健康人群中存在显著差异，rs1333049单核苷酸等位基因G的下降可能与动脉粥样硬化相关，进一步研究等位基因G与ANRIL表达的相关性发现，该两者表达存在正相关，说明染色体9p21区域单核苷酸rs1333049等位基因可能参与调控了ANRIL的表达；此外冠心病病人血清中ANRIL的表达均低于正常受试者，通过ROC 曲线可以发现 ANRIL（外显子 1-2）、ANRIL(外显子17-18)在诊断冠心病方面均具有统计学意义，ANRIL可以作为诊断冠心病发病的高特异性指标；最后本实验发现ANRIL（外显子1-2）与CDKN2A、CDKN2B表达均呈正相关，ANRIL(外显子17-18)与CDKN2A的表达呈正相关。

综上所述，ANRIL可能通过调控CDKN2A/B的表达影响冠心病的发生发展，ANRIL的表达可能受染色体9p21区域单核苷酸rs1333049表达的影响，外周血ANRIL的表达可以作为早期诊断冠心病的特异性指标。