基于LC-MS/MS 研究异夏佛塔苷在大鼠体内药代动力学及其绝对生物利用度

梁 枫，李 多，汪荣斌，舒 畅，丁 黎**

(1安徽中医药高等专科学校基础教学部，芜湖 241000；2中国药科大学药学院药物分析系，南京 210009)

天南星(Arisaema.Eubescens(wall.)Schott.) 属天南星科天南星属植物，首载于《神农本草经》，又以半夏精、掌叶半夏、蛇木相称[1]。其性味苦，辛、温、有毒，具有燥湿化痰、祛风定惊、消肿散结之功效[2]。可用于顽痰咳嗽、胸膈胀闷、风疾眩晕、口眼歪斜、半身不遂、癫痫、惊风及破伤风等疾病[3]。有研究证实：异夏佛塔苷(isoschaftoside，分子式：C26H28O14，结构见图1)作为天南星的主要成分之一，其具有保肝护肝、抗炎、抗肿瘤、清热祛湿等药理作用，具有临床应用的潜力[4]。本文建立一种快速、简便、灵敏的LC-MS/MS的分析方法，用于研究异夏佛塔苷在大鼠体内的药代动力学行为及其绝对生物利用度，旨在为异夏佛塔苷临床研究提供理论基础。

Figure 1 Chemical structure of isoschaftoside

1 材 料

1.1 药品与试剂

异夏佛塔苷(批号:52012-29-0，纯度>98%，北京北纳创联生物技术研究院)；对乙酰氨基酚(内标，批号:103-90-2，纯度>99%，中国药品生物制品检定所)；甲醇为色谱级(德国Merck公司)；去离子纯净水(自制)；其他试剂均为市售分析纯试剂。

1.2 仪 器

1200型高效液相色谱仪，6410B三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司)；Sorvall Legend Micro 17R台式高速冷冻离心机(美国Thermo Scientific公司)；ME104E型万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；双重纯水机(上海亚荣生化仪器厂)。

1.3 动 物

成年、健康32只SD大鼠，雌雄各半，体重(200±20)g。由江苏省南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，合格证号：SCXK(苏)2017-001。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 色谱与质谱条件

色谱条件：色谱柱Diamonsil C18柱(150 mm × 2.1 mm,5 μm),柱温25 ℃；流速为0.3 mL/min；流动相 A 相：甲醇，B 相：0.1% 甲酸水溶液，采用梯度洗脱(见表1)；进样量10 μL；分析时间11.0 min。

Table 1 Gradient elution procedure of mobile phase in HPLC analysis

质谱条件：离子源：电喷雾离子化源 (ESI)；检测方式：正离子模式；扫描方式：多反应离子监测(MRM)；喷雾电压：-4 000 mV；源温度：350 ℃；卷帘气：40 psi(1 psi=6.895 kPa)；碰撞气：15 psi；用于定量分析的离子反应分别为异夏佛塔苷(m/z565.1→379.1，碰撞能为30 eV)和对乙酰氨基酚 (IS，m/z152.1→110.2，碰撞能为10 eV)。

2.2 溶液的制备

2.2.1 内标对乙酰氨基酚储备液和工作溶液的配制 精密称取对乙酰氨基酚10.0 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1.0 mg/mL 的标准贮备液。精密吸取标准内标储备液适量，用甲醇逐级稀释配成质量浓度为100.0 ng/mL的内标工作液。于4 ℃保存，备用。

2.2.2 异夏佛塔苷储备液和工作溶液的配制 精密称取异夏佛塔苷10.0 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1.0 mg/mL的标准储备液。再用甲醇依次稀释成质量浓度分别为5 000.0、2 000.0、1 000.0、500.0、100.0、50.0和10.0 ng/mL的系列标准溶液。于4 ℃保存，备用。

2.2.3 异夏佛塔苷质控样品溶液的配制 精密量取异夏佛塔苷储备液用甲醇稀释制成质量浓度分别为4 000.0、400.0、30.0 ng/mL的质控样品工作溶液。于4 ℃保存，备用。

2.2.4 异夏佛塔苷血浆校正曲线及质控样品的配制 精密吸取上述异夏佛塔苷系列工作溶液10 μL，用空白SD大鼠血浆配制成含异夏佛塔苷1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0和500.0 ng/mL的异夏佛塔苷混合标准血浆样品溶液。同法制备血浆低、中、高质量浓度(3.0、40.0、400 ng/mL)质控样品。然后，按样品处理方法处理样品。

2.3 血浆样品处理

取血浆样品100 μL,添加沉淀剂甲醇(含0.1%甲酸)300 μL，涡旋3 min,12 000 r/min离心5 min，取上清液，氮气吹干后用100 μL甲醇(含0.1%甲酸)复溶，再加入内标10 μL，涡旋3 min,12 000 r/min离心5 min，取上清液进行LC-MS/MS定量分析。

2.4 药代动力学研究[5-8]

选用32只成年、健康SD大鼠，体重约200～220 g，雌雄各半，随机分成4组，每组8只。上述4组SD 大鼠均是给药前15 h禁食不禁水。其中，第1组SD大鼠(低剂量组)单剂量灌胃给药异夏佛塔苷1.5 mg/kg，第2组SD大鼠(中剂量组)单剂量灌胃给药异夏佛塔苷3.0 mg/kg，第3组SD大鼠(高剂量组)单剂量灌胃给药异夏佛塔苷6.0 mg/kg。于给药前及给药后0.25，0.5，1，2，4，6，8，10，12 h 眼底静脉丛取血 0.2 mL;第4组尾静脉注射给药异夏佛塔苷0.5 mg/kg，于给药前及给药后0.083，0.167，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6 h眼底静脉丛取血0.2 mL，均放于经肝素抗凝的管中，3 500 r/min离心10 min后分离血浆，置于0.5 mL Eppendorf 管中-80 ℃冰箱保存待测。

2.5 数据处理

采用 DAS 3.0 数据处理软件，按照非房室模型计算药代动力学参数。以8只健康SD大鼠(雌雄各半)单剂量尾静脉注射异夏佛塔苷0.5 mg/kg作为参比，计算8只健康SD大鼠(雌雄各半)灌胃给药异夏佛塔苷1.5，3.0，6.0 mg/kg的绝对生物利用度(Fabsolute)，见公式(1)：

(1)

2.6 统计学方法

3 结 果

3.1 专属性考察

分别取SD大鼠空白血浆、空白血浆中加入异夏佛塔苷和内标对乙酰氨基酚，按“2.3”项下血浆处理办法，考察方法的专属性。结果表明(见图2)：空白血浆中内源性物质不干扰入异夏佛塔苷和内标对乙酰氨基酚的测定，表明该方法的特异性良好。

3.2 线性范围和定量下限

将异夏佛塔苷系列血浆标准溶液按“2.3”项下血浆处理办法，进行LC-MS/MS分析。以异夏佛塔苷浓度为横坐标(X，ng/mL),异夏佛塔苷与内标对乙酰氨基酚之比为纵坐标(Y)进行加权(1/X2)线性回归，得异夏佛塔苷血浆标准曲线方程为：Y=0.011 08X+0.014 4(r=0.997 6),结果表明:异夏佛塔苷血浆浓度在1.0～500.0 ng/mL范围内线性关系良好。

Figure 2 Chromatogram of blank rat plasma (A);blank rat plasma+isoschaftoside (50.0 ng/mL)+internal standard (100.0 ng/mL) (B);blank rat plasma+isoschaftoside (1.0 ng/mL)+internal standard (50.0 ng/mL) (C)

3.3 精密度与准确度

按“2.2.4”项下配制低、中、高3种不同异夏佛塔苷血浆质控样品，按“2.3”项下血浆处理办法，进行LC-MS/MS分析。每个浓度平行配制6份，并连续测定3 d，分别计算日内和日间精密度，结果见表2。结果表明：该分析方法的准确度和精密度良好，均符合样品分析要求。

Table 2 Inter-and-intra-batch precision and accuracy of isoschaftoside in rat plasma

3.4 基质效应与提取回收率

按“2.2.4”项下配制低、中、高3种不同异夏佛塔苷血浆质控样品，按“2.3”项下血浆处理办法，进行LC-MS/MS分析。记录异夏佛塔苷和对乙酰氨基酚的峰面积为A1、A2；将空白血浆和相应工作溶液进样记为B1和B2；与相应的工作液直接进样记为C1和C2。异夏佛塔苷的提取回收率为A1/B1×100%，基质效应为B1/C1×100%，对乙酰氨基酚的提取回收率为A2/B2×100%，基质效应为B2/C2×100%。结果见表3。结果表明：低、中、高3个浓度提取回收率和基质效应良好，满足生物样品中药物的分析要求。

3.5 稳定性考察

按“2.2.4”项下配制低、中、高3种不同异夏佛塔苷血浆质控样品，考察样品室温放置6 h，-80 ℃循环冻融3次以及-80 ℃长期冻融10 d稳定性，并按“2.3”项下处理后的样品于进样器放置12 h，考察处理后样品进样器放置的稳定性，结果见表4。结果表明：低、中、高3个剂量在上述条件下稳定性良好，可用于生物样品中药物的分析要求。

Table 3 Martix effect and recovery of isoschaftoside and IS in rat

Table 4 Stability of isoschaftoside in rat plasma

3.6 异夏佛塔苷在大鼠体内药代动力学

SD大鼠单剂量灌胃给药异夏佛塔苷1.5，3.0，6.0 mg/kg，尾静脉注射异夏佛塔苷0.5 mg/kg后，按“2.4”项下采集的各时间点血浆样品，并按“2.3”项下血浆处理办法，进行LC-MS/MS分析。测定异夏佛塔苷的大鼠血浆浓度。灌胃给药异夏佛塔苷1.5，3.0，6.0 mg/kg后的血药浓度-时间数据曲线见图 3，尾静脉注射异夏佛塔苷0.5 mg/kg后的血药浓度-时间数据曲线见图4。采用DAS3.0软件和非房室模型统计矩方法计算药代动力学参数，药代动力学参数见表5。

Figure 3 Mean plasma concentration-time profiles of isoschaftoside in rats after ig administration

Figure 4 Mean plasma concentration-time profiles of isoschaftoside in rats after iv administration(0.5 mg/kg)

Table 5 Pharmcokinetic parameters of isoschaftoside after ig or i.v administration

3.7 异夏佛塔苷在大鼠体内的绝对生物利用度

本试验以SD大鼠单剂量静注给药异夏佛塔苷0.5 mg/kg后体内血药浓度-时间曲线下面积AUC0-∞为参比，计算SD大鼠单剂量灌胃给药异夏佛塔苷1.5，3.0 ，6.0 mg/kg 3个剂量组后异夏佛塔苷入血的绝对生物利用度。考虑到SD大鼠动物实验个体差异的特殊性，采用8只SD大鼠单剂量灌胃给药异夏佛塔苷1.5，3.0，6.0 mg/kg及8只SD大鼠单剂量静注给药异夏佛塔苷0.5 mg/kg后异夏佛塔苷入血的AUC0-∞的平均值进行比较，得到异夏佛塔苷在SD大鼠体内的绝对生物利用度(%)分别为6.73、5.99、5.80。

4 结 论

异夏佛塔苷作为一种黄酮类成分，利用LC-MS/MS方法探讨异夏佛塔苷在大鼠体内的药代动力学行为及绝对生物利用度未见文献报道。因此，本实验建立一种快速、专属性强、灵敏度高、检测下限低的LC-MS/MS分析方法。血浆提取办法考察了蛋白沉淀法(沉淀试剂考察甲醇、乙腈、甲醇(含0.1%甲酸)和乙腈(含0.1%甲酸)、液液萃取法(萃取试剂考察乙醚、甲基叔丁基醚和正己烷)以及沉淀吹干的样品提取方法。本实验最终采用沉淀吹干法，沉淀试剂选用甲醇(含0.1%甲酸)。该提取方法具有高回收率、低基质效应以及较好的重现性。本实验基于LC-MS/MS所建立的异夏佛塔苷定量范围为1.0～500.0 ng/mL，能充分满足本实验研究的需要。此方法的专属性、准确度、精密度、基质效应、稳定性均符合方法学要求，适用于大鼠体内血药浓度测定及绝对生物利用度研究。