iTRAQ技术筛选急性心肌梗死动物血清早期潜在标记物的试验研究

娄江杰 翁莹政 曾广忠 刘小伟 金红峰 王亚利 杜常青 徐晨凯 唐礼江

急性心肌梗死（AMI）病情进展迅速，早期开通阻塞的冠状动脉可以减轻心肌坏死，降低病死率，改善患者的预后，因此疾病早期的准确诊断至关重要。但是只有少数患者有典型的临床表现，约50%没有特异的心电图改变[1]。目前快速有效的诊断方法是生化标记物的检测，指南推荐的AMI诊断标记物为血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）和肌钙蛋白，AMI发生后约 2～3h升高，24～48h达到高峰。这两个标记物虽然有较高的灵敏度和特异度，但在AMI发生后的3h内诊断价值有限。因此寻找一种兼具特异度和灵敏度的AMI早期标记物极为迫切，而新型检测技术的出现为此提供了可能。同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技术是一种基于体外同位素标记的定量技术，该技术具备定量精确、低误差、高效率、适用范围广等优点，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术[2]。本研究采用8标iTRAQ技术联用高分辨质谱技术，借助生物学信息分析手段，对动物发生AMI 6h内的血清样本进行差异蛋白分析，旨在寻找潜在的AMI早期生物标记物，提高AMI的早期确诊率。

1 材料和方法

1.1 实验动物 10～13个月龄健康比格犬32条，雌雄各半，体重10～12kg，均购自上海新冈实验动物场[许可证号：SCXK（沪）2012-0009]。

1.2 试剂和仪器 甲酸铵、乙腈、BCA定量试剂盒由美国Thermo公司提供；胰蛋白酶购自美国Promega公司；聚乙烯微球悬浮制剂购自美国 Bangs Laboratories公司；凝血酶冻干粉由浙江杭康药业有限公司提供；10kD超滤离心管购自美国Millipore公司；iTRAQ 8标试剂盒、TripleTOF质谱仪、C18上样柱（Sciex POROS R2，100μm*4cm，10μm，2500A）购自美国AB SCIEX公司，高 PH 色谱柱 （Waters Xbridge 4.6×100mm column，5μm，200A）、C18分析柱（Waters Xbridge column，100cm，ID25μm，3.5μm，C18-A2）、C18 萃取柱、Waters NanoAcquity多维色谱仪由美国Waters公司提供；AKTA Purifier 100纯化仪购自美国通用电气公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组 采用随机数字表法选取雌雄比格犬各1条，设为假手术组，其余30条犬设为AMI组。

1.3.2 比格犬AMI模型建立 比格犬穿刺股动脉行冠状动脉造影，沿导丝送入预扩球囊至前降支第二对角支处，间隔30s行缺血预适应，撤出球囊，沿导丝送入微导管至前降支第二对角支远端，经微导管快速注入聚乙烯微球悬浮制剂2ml，随后注入凝血酶粉制剂2ml。间隔5～10min行冠状动脉造影确认血流阻断后，结束手术。假手术组只进行冠状动脉造影，不注射聚乙烯微球悬浮制剂和凝血酶粉剂。

1.3.3 样品的制备 于术前和术后1、2、3、6h抽取静脉血，分离血清保存至-80℃冰箱备用。取血清样品加入适量SDT裂解液，沸水浴15min。14 000r/min离心40min，取上清液。采用BCA法进行蛋白质定量。分装样品，-80℃保存。

1.3.4 蛋白样品酶解及iTRAQ标记 各样品取30μl裂解后的蛋白质溶液，采用超滤管酶解法进行酶解[3]。收集滤液，采用C18萃取柱对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μl复溶液复溶。各样品分别取100μg肽段，按照AB SCIEX公司8标iTRAQ标记试剂盒说明书进行标记。假手术组用 113 标记，AMI组造模后 1、2、3、6h 样本依次用 114、115、116、117 标记。

1.3.5 高pH-RP分级 将每组标记后的肽段混合，采用AKTA Purifier 100纯化仪进行分级。色谱柱以A液（10mM 甲酸铵，5%乙腈，pH 10.0）平衡，B 液（10mM 甲酸铵，85%乙腈，pH 10.0）从0%到100%进行梯度洗脱，样品由进样器上样到高pH色谱柱进行分离，流速为1ml/min。每隔2min收集洗脱组分，分别冻干后采用C18萃取柱脱盐。

1.3.6 高效液相色谱分离及质谱分析 每份样品采用Waters NanoAcquity多维色谱仪进行分离。缓冲液A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液。色谱柱以95%的A液平衡，样品由自动进样器上样到C18上样柱，经过C18分析柱分离，流速为5nl/min。样品经色谱分离后用TripleTOF质谱仪进行质谱分析。

1.3.7 生物学信息分析用Mascot2.3和ProteinPilot 4.5进行查库鉴定及定量分析。使用数据库为Uniprot_Canislupusfamiliaris_29014_20160822.fasta。将符合表达差异倍数＞1.2倍（上下调）且P＜0.05筛选标准的蛋白质视为差异蛋白。分别对各个时间点鉴定到的差异蛋白进行基因本体（Gene ontology，GO）功能注释和富集分析。

2 结果

2.1 4个不同时间点差异蛋白统计结果 为了尽量减少在实验过程中产生的实验误差，一共进行了两次质谱鉴定，共鉴定到肽段总数为4 541，唯一肽段数为4 082，蛋白质组数为691。对各时间点的数据进行分析，得到不同时间点的差异蛋白，见表1。

2.2 差异蛋白出现的时间点 对AMI 6h内的差异蛋白进行综合分析，筛选AMI早期稳定变化的差异蛋白，并计算出各蛋白浓度和假手术组蛋白浓度的倍数关系。排除未命名蛋白和犬特有蛋白后，共发现15种AMI早期出现的差异蛋白，见表2。

表1 4个不同时间点差异蛋白统计结果（种）

2.3 差异蛋白GO功能注释和富集分析 对各个时间点的差异蛋白进行GO功能注释，使用Uniprot数据库中动态更新的标准化词汇描述差异蛋白显著相关的生物学功能，并对注释的结果进行富集分析，在4个时间点最显著前30条（依P值从小到大排列）GO条目中，共发现7条共有条目，分别是氧气运输、气体运输、血红蛋白复合体、氧气结合、蛋白复合体、亚铁血红素结合、四吡咯化合物结合。对筛选出的差异蛋白的GO条目进行分析，罗列出至少三个差异蛋白共有的条目，见图1。鉴定出的15种差异蛋白涉及的主要生物学过程为细胞代谢，最主要的分子功能为蛋白结合，大部分蛋白定位于胞内的细胞器。

表2 差异蛋白出现的时间点

图1 差异蛋白GO富集分析（注：蓝色代表生物学过程，黄色代表分子功能，绿色代表细胞组分）

3 讨论

AMI发病后1h内得到救治，病死率约为1%，发病6h后得到救治，病死率则高达10%～12%，因此寻找早期诊断AMI的标记物具有重要的临床意义[4]。目前有文献报道的AMI早期潜在标记物包括P-选择素、α-肌动蛋白、碳酸酐酶Ⅲ、脂肪酸结合蛋白等十余种，但临床价值有限[5]。iTRAQ技术可以寻找差异蛋白，并分析其蛋白功能，同时可以对1个基因组表达的全部蛋白质或1个混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定[6]。目前利用iTRAQ技术研究各种疾病的诊断标记物已成为热点。

利用iTRAQ技术，本研究对不同时间点差异蛋白进行综合分析，重点筛选出了15种在AMI后6h内出现的差异蛋白。通过对这15种差异蛋白进行进一步的生物信息学分析，亚细胞定位显示，在细胞器内，细胞质，细胞外基质，细胞膜上均有差异蛋白的表达。功能分析则表明这些差异蛋白具有结合、催化和水解酶活性等重要作用，并参与代谢、对刺激的反应、生物调节、定位等生物过程。

肌球蛋白是一种马达蛋白，属于超家族蛋白，种类庞大，目前一共发现24种[7]。肌球蛋白可以通过ATP供能，在肌动蛋白上滑动，进而发挥多种功能，如细胞器运输、有丝分裂和细胞移动[7]。有研究表明，MYO1A在保持细胞膜的张力中起关键性作用[8]，同时也是肠微绒毛刷状缘的重要组成成分[9]。MYO18A在维持高尔基体的定位中起作用，还是细胞骨架和膜表面受体的组成成分[10]。总的来说，肌球蛋白功能复杂，而且不同的肌球蛋白亚型之间，功能差别较大。有研究认为肌球蛋白轻链在AMI后3～6h内升高，可以作为AMI早期标记物[5]，间接支持了MYO1A和MYO18A有作为AMI早期标记物的可能性。

APOE、APOF主要由肝脏合成，血管壁的巨噬细胞也可以部分合成APOE，它们的主要作用是调节血脂浓度，其对动脉粥样硬化的保护作用已得到公认。越来越多的研究证明，APOE还可以调节免疫功能，调控细胞生长和分化[11]，而且这些作用独立于APOE的脂类运输作用。血小板激活是急性心肌梗死发生的关键性病理变化，APOE能刺激血小板合成NO，抑制血小板聚集[12]。国内也有一些文献报道AMI患者APOE的浓度较对照组升高。

本研究虽然还发现了一些AMI早期出现的差异蛋白，由于目前没有相关研究证明这些差异蛋白和心肌相关，作为AMI早期诊断标记物的潜力不大。例如CA2是一种能催化二氧化碳和水生成碳酸氢根和氢离子的金属酶，分布广泛，与多种病理及生理活动相关，虽然在AMI后1h就开始持续升高，但有研究证明多种肿瘤疾病如鼻咽癌患者[13]，CA2也会升高，这影响了CA2诊断AMI的特异度。FN1是血小板α颗粒成分之一，参与了血小板黏附聚集的过程，可能在AMI的病理变化中发挥一定的作用，但有研究证明FN1和肿瘤相关，也不首选作为进一步研究的对象[14]。CTSG主要在炎症反应中起作用，还可以降解细胞外基质和激活血小板[15]，在AMI后1h就开始持续降低，可能也在AMI的病理变化中起一定作用。

总之，本研究利用iTRAQ技术筛选比格犬AMI早期生物标记物，对筛选出的差异蛋白进行功能分析并查阅相关文献，发现MYO1A和MYO18A作为AMI早期标记物有一定的可行性，有深入研究的价值。本研究主要的不足之处是没有对筛选出的差异蛋白进行验证，结果的临床价值还有待证实，进一步的研究将对筛选出的15种差异蛋白进行验证，尤其对MYO1A和MYO18A进行重点研究。