红曲菌深层发酵工艺技术

广东天益生物科技有限公司 广东湛江 524300

红曲是指以大米为原料，用红曲菌属红曲霉菌发酵培养制得，是具有中国特色的传统发酵产品。红曲可分为色曲(作为食品添加剂)、酒曲(作为酿酒糖化发酵用)和功能性红曲(作为保健品和药品原料)。红曲自古以来就具有食用和药用价值，药用价值在《本草纲目》中早有记载：红曲甘温无毒，主治：消食活血、健脾燥胃、治赤白痢下水谷，酿酒破血行药势及产后恶血不尽等。色曲则用作食品添加剂的红曲色素，在食品中起着色增香作用，已广泛用于肉制品、调味品、糕点、糖果、饮料等行业，尤其在肉制品中应用最广。因红曲色素与蛋白质类结合非常牢固，耐光耐热性好，不易褪色，应用于肉制品加工，可起到发色、防腐等作用，可以减少肉制品中亚硝酸盐的用量，且食用时口感更佳，提高了产品的品质和安全性。功能性红曲是指红曲菌在发酵过程中可合成具有生物活性的代谢产物，如莫纳可林K、麦角甾醇、辅酶Q10等的一类红曲，具有非常好的保健、药用价值。

作为我国药食两用，具有上千年生产应用历史的传统产品红曲，其生产方式主要采用传统的固态发酵法，工艺相对简单、成熟，如地面制曲、曲盘制曲，但生产条件相对粗放，发酵周期长，杂菌污染率高，存在食品安全隐患，加之劳动强度大，产能严重受限。其后发展为通风制曲，生产环境得以改善、发酵水平、产品质量、产能等都有大幅提高，但仍属开放式培养，污染杂菌和桔霉素超标问题，严重制约了行业的发展。

功能性红曲的生产，因发酵周期长，工艺技术要求高，从最初的浅盘制曲，到现在规模化的三角瓶生产制曲，桔青霉素等有害成分的代谢得到了较好的控制，但存在劳动强度大，产品质量波动及产能受限等。而采用大容量的固态发酵装置(发酵罐)，技术欠成熟，投入产出比低，目前在中国尚未能规模化生产。

随着生物工程技术的不断进步，红曲液态发酵工艺和技术在20世纪80年代取得进展，深层发酵红曲色素在90年代初就实现了规模化生产。随着技术的进步，研究的深入，通过对菌种持续的筛选、生产工艺不断的优化，红曲菌在流动的米粉基质内，辅以充足的无菌空气，纯种红曲菌生长代谢旺盛，能大幅度缩短生产周期，发酵水平得到大幅提高，目前60m3发酵罐的发酵周期3d左右，发酵色价高达920U/mL，有望突破1 000U/mL，年平均发酵水平可达800U/mL。

由于液态发酵生产工艺和配方可控性强，易于实现自动化、规模化生产，提高产能，不仅生产成本能有效控制；而且能有效控制红曲代谢过程中桔青霉素的产生，(桔青霉素含量<0.04mg/kg，以单位色价计)，产品杂质少、色调纯正、质量稳定，在天然色素产品中性价比非常高，深受食品加工行业的青睐，对食用着色剂行业产生了划时代的影响。

红曲米作为传统的着色剂，主要赋予食品着色的功能，在我国食品加工业中仍然有较大的市场，目前，红曲米国家标准尚未将桔青霉素含量指标纳入国家标准。由于固态发酵工艺生产的红曲米，普遍存在桔青霉素含量超标问题，严重制约了红曲米的广泛应用，已成为我国红曲米出口的瓶颈，我国红曲米已基本退出欧美等市场。

1 液态发酵红曲米的生产

为了解决固态发酵工艺红曲米桔霉素超标问题，广东天益集二十多年对红曲液态发酵的研究和生产经验，通过工艺配方的改进，探索利用液态发酵工艺生产红曲米。

斜面菌种→种子液培养(6～10d)

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工艺流程：大米→磨浆→配料→灭菌→发酵罐培养(70～80h)→均质→喷雾干燥→筛粉→包装→成品。

以大米为原料，制作成液体培养基，采用机械搅拌发酵罐作为容器，进行红曲菌纯种发酵，通入无菌空气，减少杂菌污染的机率，让菌体迅速生产和合成代谢产物红曲色素。通过对发酵工艺条件多方面的调控，控制次级代谢产物桔青霉素的产生。随着发酵时间的增加，菌体产生的代谢物质色素含量也逐步增多，产品色价也是逐渐提高(如图1)。因此，可以根据终产品的色价确定发酵周期，终产品色价要求高发酵周期相对延长(80h以上)，色价要求低发酵周期就短，发酵周期可灵活掌控，但从生产成本和效率的角度考虑，发酵到终点是最佳的。

表1 固态、液态发酵红曲米产品质量对比情况(公司数据)

对固态发酵与液态发酵红曲米产品进行代谢产物的分析检测(表1、表2)，表明液态发酵红曲米的色价可达到>9 000u/g，同时对应的桔青霉素含量能达到红曲色素国标要求≤0.04mg/kg(以单位色价计)；与固态发酵红曲米产品色价相同的条件下比较，液态红曲米的桔青霉素和黄曲霉毒素B1等指标均可以得到有效控制。

从我们内部检验数据分析，桔青霉素含量在发酵过程中可以控制在非常低的范围而且很稳定，可以彻底解决产品的安全性问题。

表2 固态、液态发酵红曲米产品质量对比情况(第三方机构检验数据)

通过固、液态发酵工艺对比：固态发酵红曲米产品含有大量淀粉，其次是色素；液态发酵生产红曲色素、红曲米，主要代谢产物是色素，而菌丝体中含有非常丰富的营养物质，具有良好的利用价值。李燚等[1]对红曲色素生产中的菌丝体进行成分分析，发现红曲霉液态发酵菌丝体的色价较高，营养丰富，高蛋白，低脂肪，富含不饱和脂肪酸及多种微量元素，有毒金属含量很低，安全无毒；还含有莫拉可林K、γ-氨基丁酸、麦角固醇等多种功能性成分，具有一定的降血脂、降血压功效。吴铁等[2]采用红曲液态发酵工艺提取色素后剩下的红曲菌丝体的提取物，经动物实验发现具有降血脂和预防骨质疏松的作用，可以作为功能性食品或保健食品配料，具有极高的应用开发价值。因此从生产工艺控制、产品质量、营养价值等多方面比较，液态发酵红曲色素、红曲米工艺的优势都是非常明显的(见表3)。

表3 固态、液态发酵红曲米生产方式的对比情况

2 液态发酵功能性红曲的生产

2.1 固态发酵工艺

固态发酵功能红曲，是将红曲菌接种在蒸熟的米粒上，在一定的温度、湿度、通风等条件下，红曲菌在米粒培养基上生长、繁殖、代谢，其标志性产物为Monacolin K。目前以三角瓶生产方式为主，投入少、技术相对成熟，标志性产物Monacolin K的发酵水平可以达到3.5%以上，桔青霉素含量基本能控制在标准范围内。

斜面菌种→种子液

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大米→蒸饭(灭菌)→冷却→接种→发酵培养(30～35d)→干燥→粉碎→筛粉→包装。

具体操作步骤如下。

(1)斜面培养。将试管菌种接种于斜面培养基，置30～35℃恒温箱培养6～10d。

(2)种子液培养。采用三角瓶扩大培养，接种量5%，30～35℃恒温培养30～48h。

(3)配料。以大米为原料，配制成固体培养基，经过灭菌后冷却待用。

(4)接种、培养。接种量10%～15%，24～28℃培养25～35d。

(5)干燥、粉碎、筛粉、包装。达到发酵终点，放瓶干燥，再经过粉碎、筛粉后包装粉末状成品。

固态发酵具有投资低、能耗低等优点，但菌体生产速度比较缓慢，发酵周期长，质量易波动，占地面积大，自动化程度不高，劳动强度大，生产成本比较高，产能增加的局限性很大，工艺技术水平难以提升，不利于红曲推广应用，产业发展受限。

2.2 液态发酵工艺

液态发酵功能红曲。以大米或其他淀粉质原料，制成液体培养基，采用机械搅拌大容量的发酵罐,在罐内通入无菌空气进行红曲菌纯种发酵，根据菌体发酵各时段对培养条件的需求，对工艺参数进行灵活控制。

斜面菌种(6～10d)种子液培养

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采用液态发酵工艺，基质的混合和扩散非常均匀，有效的提高溶氧和其它营养成分的传递扩散速度，利于抑制桔青霉素的生成，促进目标代谢产物的合成。这种方式的优势非常明显：有效利用现代生物工程技术，自动化程度高，产品污染率低，工艺可控性强，可有效缩短发酵周期，批次产品质量均一，产能容易提高，具有巨大的发展潜力。红曲菌深层发酵红曲色素的产业化是20世纪90年代初红曲行业的重大突破，也是红曲行业技术进步的标志之一。

功能红曲液态发酵技术至今还未形成规模化生产，在工艺技术方面尚需深入研究，可从菌种的选育、培养基的原料种类、碳氮比、温度、溶氧值工艺技术等关键控制参数方面着手，达到提高代谢产物浓度，缩短发酵周期，形成规模化生产之目的。

(1)菌种的选育。通过对菌种的诱变，筛选出适合深层发酵工艺的菌株，并且达到高产Monacolin K等功能活性物质，低产或不产桔青霉素等有害物质的目的。

(2)原料种类。传统功能红曲的发酵一般采用大米为原料，一些实验研究报道表明，红曲菌在多种谷物或淀粉质原料上均生长良好，目标代谢产物Monacolin K的含量高，桔青霉素含量也能控制得当。陈勉华[3]等采用大米、玉米、高豌豆、糜子、黑米、麦麸等10余种谷物培养基进行实验，并且通过多种谷物复配使用，可以提高Monacolin K和GABA的含量，还能成功抑制桔青霉素的生成。淀粉质原料如葡萄糖、甘油、其他糖醇类等添加玉米浆、酵母抽提物也能有效促进红曲菌的生长和提高代谢产物的合成，达到同样的效果。由于各种谷物对人体都有不同的益处，而这些谷物都非常易得，利用红曲菌可以将不同种类谷物和淀粉质原料制备成多样化的具有降脂功能的红曲食品，丰富人们的饮食生活，又能达到保健目的。

(3)碳氮比。深层发酵培养基中的碳源主要是谷物或淀粉类物质，如大米、燕麦、葡萄糖、甘油等，氮源为玉米浆、黄豆粉、蛋白胨、酵母抽提物等物质，高浓度发酵从理论上是能提高发酵效率，但高浓度也会使菌体生长受抑制，代谢产物合成减少；低浓度发酵中后期营养耗尽后劲不足，无法正常分泌代谢产物，发酵水平也不理想。因此，适当的碳氮比例对发酵过程中菌体生长和溶氧效果、产物的代谢都有着直接的影响，另外发酵过程中可据菌体的生长情况和培养基的残糖，采用补料的方式，适当给菌种增加营养物质，提高菌体的代谢能力。

(4)温度。温度是发酵控制的关键参数，是菌体生长、分泌代谢产物和有害物质非常关键的环境因素。红曲菌发酵初期是菌体生长快速期，前期适当提高温度使菌体迅速生长、繁殖快，缩短发酵周期；发酵中期、后期是合成、分泌代谢产物的关键期，可以促进Monacolin K的合成和代谢，控制低温可以有效抑制桔霉素的合成。

(5)溶氧。深层发酵工艺溶氧效果主要与机械搅拌、通风比、培养基的浓度比等因素有关。在这些影响因素中，搅拌转速是影响红曲菌液态发酵罐发酵的菌体和Monacolin K产量的最重要的因素。发酵过程中菌体对溶氧在不同时期有不同要求，应根据具体发酵罐体积、浓度比等条件而定，合理调整搅拌转速，使得菌体能正常生长，促使菌体高效合成目标产物，提高发酵水平。

2.3 代谢产物

自上世纪80年代以来，功能性红曲中的Monacolin类化合物被陆续发现并证实具有显著抑制体内胆固醇合成的活性，Monacolin类化合物中Monacolin K是最主要的他汀类物质，是一类高效的降脂药物，能有效地抑制胆固醇合成限速酶HMG-CoA还原酶的活性，降低人体内源性胆固醇合成，减少细胞内胆固醇贮存，降低血液中低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)的浓度[3]，提高血液中高密度脂蛋白胆固醇的浓度，从而有效地预防动脉粥样硬化，甚至能逆转动脉粥样硬化。红曲菌在代谢过程除了可以产生Monacolin类化合物，还有其他活性功能成分陆续被发现，如γ-氨基丁酸(降血压)、麦角甾醇(预防骨质疏松)、辅酶Q10(抗衰老)、支链氨基酸等(减肥)，Dimerumic酸(护肝)、黄酮酚(抗氧化)，红曲多糖(调节免疫力)、红曲黄色素(抗癌)等。

降脂红曲中Monacolin K有酸式和内酯型两种构型，人体中真正发挥作用的是酸式Monacolin K，它可以直接被人体吸收，不需要人体内的羟基酯酶参与水解，不增加肝、肾负担，直接发挥降脂作用[4]。固态发酵功能性红曲产品中莫纳可林K(MK)是同时含有开环结构和闭环结构的，在发酵10d及以前都是开环，在其后的发酵过程中开环结构比例会大幅度减少，后处理的烘干工艺会造成这两种比例的变化。产品烘干过程中，温度越高，烘干时间越长，则开环结构转化为闭环结构的就越多，一般最终成品中闭环结构达80%以上。市场销售的降脂红曲产品中，闭环结构占比达80%以上，闭环结构无活性，需经人体产生的羟基酯酶水解，改变结构后才能产生活性，发挥降脂功能。固态发酵功能红曲产品除了含有降脂功效的Monacolin K之外，还含有大量的残余淀粉，由于其水溶性差，无法直接添加到液态食品中使用，因此常用红曲粉胶囊作为保健品或药品的终端产品形式，这很大程度上限制了功能性红曲的使用范围。

近几年，广东天益生物科技有限公司也一直在从事液态发酵功能红曲生产工艺的研究和探索，并获得一定的实验成果，完成了摇瓶小试实验和1.5m3发酵罐的中试实验，平均发酵水平Monacolin K含量能达到700mg/L，最高可达到960mg/L。经检测分析见表4，表5，红曲菌液态发酵代谢产物中可以检测到多种有效活性成分，如Monacolin K、麦角甾醇、γ-氨基丁酸、红曲多糖等物质，同时还发现发酵液中的主要功能成分Monacolin K，酸式占比非常大，内酯式Monacolin K很少。液态发酵菌丝体可以同时分泌胞外和胞内代谢产物Monacolin K，由于菌丝体浓度较低，胞内产物的占比也较少，分泌到胞外的Monacolin K占总量的75%以上，而且都是胞外产物水溶性Monacolin K。这些胞外水溶性Monacolin K更有利于人体的吸收利用，将发酵液分离菌丝体后，菌丝体可以加工成粉状功能红曲产品，滤液可以直接开发成液态食品，将功能红曲开发成普通食品如乳制品、饮料、调味品、酒等，开拓液态功能红曲食品的新领域，让更多人受益。

表4 内部实验室检验数据(液相色谱法)

表5 第三方机构检验数据

功能红曲有效活性成分陆续在研究过程中被发现，但由于目前国内外对有效活性成分的检验方法的研究比较少，也没有制定统一、标准的检验方法，对有效活性成分的定量分析检验结果存在较大的差异，并且由于方法不一致，可能无法检测到某些成分，不利于功能红曲产品的开发。

3 展望

当前，红曲米、功能红曲等产品大都采用固态发酵生产方式，红曲色素产品(>95%)是采用液态发酵生产方式。固态发酵或液态发酵的生产方式，各具优势和特点，固态发酵投资少、设备简单，生产条件相对粗放，发酵周期长，杂菌污染率高，存在食品安全隐患，工人劳动强度大，自动化程度不高，产能提升受限明显，行业发展较为缓慢；液态发酵投资大、设备相对复杂，自动化程度高，工艺可控性强，能促进目标代谢产物之合成，发酵周期短，产品污染率低，能有效抑制桔青霉素的生成，确保红曲产品的安全性和质量稳定，产能提升快，能满足健康食品行业的规模化需求，具有巨大的发展潜力，从而促进行业能迅速发展。结合国家倡导，国民期盼的大健康产业的发展，从食品安全、技术进步和行业的健康发展等综合因素考量，红曲液态发酵工艺都具有明显的发展优势。

目前，制约我国红曲产业发展主要问题。

一是红曲产品应用定位问题，红曲米与红曲色素均被以食品添加剂(着色剂)收录在GB2760中，主要赋予食品着色的功能，并严格限制其使用范围及使用量，而红曲具有功能性食品的属性未能得到开发应用，严重制约了红曲产品的应用和行业的发展。

二是产品标准与行业技术创新和发展不匹配，功能性红曲产品目前只有轻工行业标准(QB/T2847-2007)，没有制定相应的国家标准，产品的生产和销售在法规上难于合法化；红曲米国家标准(GB1886.19-2015)虽未明确生产工艺方式，但职能监管部门仍然认可的是固态发酵工艺，使液态发酵红曲米生产工艺受到质疑，由于传统的固态发酵工艺很难有效控制桔青霉素的产生，而红曲米国家标准至今没有列入桔青霉素指标，目前桔青霉素超标问题成为红曲米拓展国外市场的瓶颈。标准中对红曲发酵工艺方式的限定，严重制约了行业的技术创新和发展，成为红曲产业技术创新与健康发展的瓶颈。

红曲在我国已有上千年生产应用历史，是中华民族的智慧结晶，是祖先留下的瑰宝，是具有药、食两用的传统产品。随着现代科技的发展和生物技术的进步，对红曲研究的深入，红曲代谢产物及许多新的功效作用不断被发现，随着经济的发展，生活水平的提高，人们对健康意识的增强，对食品的要求不再仅限于色、香、味、俱全，对食品的营养和功能有了新的追求，红曲正是具有“天然、营养、功能性”的特点，成为众人关注的焦点，因此，红曲更应该作为食品配料开发，充分挖掘红曲功能性食品的属性，而不仅仅是作为食品添加剂应用，围绕大健康产业，大力开发红曲健康食品；其次，应将传统产品与现代技术紧密结合，在传承的基础上应用现代生物技术挖掘红曲精髓，充分发挥液态发酵工艺优势，以新工艺、新技术的应用，推动行业技术创新与产业升级，让千年红曲焕发生机，让红曲为人类的健康发挥更大的作用。