肾脏足细胞B7-1抗原呈递与CTLA4-Ig研究进展

程金波 熊加川 综述 赵景宏 审校

足细胞作为终末分化的上皮细胞，是肾小球滤过屏障的重要组成，通过其独特的细胞足突与多孔滤膜结构，在原尿的生成中起重要作用。因其在肾小球微环境中独特的分布位置及功能，足细胞容易与通过滤过屏障血流中所携带的各种抗原相接触，如细菌、病毒、毒素及炎症因子等，因此足细胞有可能演化出类似抗原呈递效应的反应机制并扮演类似固有免疫细胞。如树突状细胞或巨噬细胞功能的角色。已有的研究证实了这种可能[1]，同时利用细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA4)的胞外细胞域或人IgG1重链恒定区构建的重组融合蛋白(CTLA4-Ig)特异性地阻断B7-1表达可阻断足细胞自身的抗原呈递途径，并有可能使部分以蛋白尿为表现的足细胞疾病患者受益[2]。但围绕着足细胞是否可特异性地阻断B7-1及CTLA4-Ig在肾脏病临床应用争议不休，因此在下一步研究中，能否寻找到高重复性检测足细胞特异性表达B7-1的方法将是至关重要的一步[3]。

B7-1抗原呈递及CTLA4-Ig

抗原呈递是机体免疫系统进行免疫识别、应答及效应调控的重要生理过程。机体免疫系统在对抗原的摄取、加工及处理并形成抗原肽的同时，包括树突细胞、巨噬细胞及活化的B 细胞等在内的专职抗原呈递细胞会同时表达主要组织相容性复合物Ⅱ(MHC-Ⅱ)和协同刺激分子B7家族蛋白，如B7-1(又称CD80)、B7-2(又称CD86)等，与辅助T细胞(Th细胞)受体CD28 家族分子结合，从而激活CD4+Th细胞，通过分泌细胞因子、募集并激活其他免疫细胞来启动免疫反应。在某些疾病状态下，抗原呈递也可成为机体自身免疫反应的关键环节[4]。除上述专职抗原呈递细胞外，上皮细胞、血管内皮细胞、皮肤纤维母细胞及脑内的小胶质细胞均可扮演兼职抗原呈递细胞的角色。研究表明，作为终末分化的足细胞，在特定致炎因素作用下，亦可具有抗原呈递的特性，且以表达B7-1为主，目前尚无B7-2在足细胞特异性表达的证据[1]。

CTLA4-Ig通过选择性结合B7-1分子，阻断T细胞与抗原呈递细胞之间B7-CD28共刺激通路，阻滞T细胞的活化以及由此介导的免疫反应，从而表现出免疫调节作用[5]。阿巴西普(Abatacept)作为目前临床常用的CTLA4-Ig制剂，经美国FDA批准已上市，其疗效已在包括类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、系统性红斑狼疮及肾移植排斥反应等多种疾病的临床实践中得到验证[6-7]。本品的常见不良反应为头痛、恶心、眩晕、咳嗽、背痛及皮疹等。因 CTLA4-Ig的分子量约为100 kD，不能被肾脏滤过，在合并肾功能受损患者中应用，无严格剂量限制[8]。

足细胞B7-1抗原呈递

研究表明，足细胞在多种刺激因子作用下能够表达B7-1[1,9]。如在足细胞培养模型中，加入脂多糖，可出人意料检测出B7-1的表达，脂多糖还可通过Toll样受体4(TLR-4)与足细胞肌动蛋白细胞骨架结合，最终影响足细胞裂孔隔膜的功能。在B7-1敲除的转基因小鼠模型研究表明，给予脂多糖及高糖刺激下，模型小鼠不会产生一过性的蛋白尿，这表明蛋白尿的产生是B7-1依赖的。在小鼠肾病综合征模型中，也可观察到在脂多糖诱导后，足细胞不但表达B7-1，同时伴随着足细胞形态变化以及一过性轻微尿蛋白的产生。同样缺氧诱导因子1可通过与B7-1相互作用影响足细胞的细胞骨架重排，进而增加足细胞的活动性。给小鼠注射Toll样受体激动剂聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(polyIC，一种合成的双链RNA)，不但可以使小鼠短暂出现蛋白尿，免疫组化还显示肾脏足细胞表达B7-1，并伴随尿中B7-1 的明显升高。临床研究表明在肾病综合征微小病变(MCD)患者中，尿液中可检出完整蛋白(分子量为5 300D)形式的B7-1，而并非血液中的游离片段(分子量为2 300D)，这也说明尿液中的B7-1可能来源于肾脏本身的分泌，而非来自血液的滤过。研究表明在T或B细胞缺失的SCID小鼠模型中，应用CTLA4-Ig阻断足细胞B7-1后可观察到尿蛋白减少，该研究表明足细胞自身表达的B7-1在蛋白尿的产生中起主要作用，不一定需要完整的免疫系统参与。

研究表明，在免疫机制介导的肾脏疾病中如，足细胞不仅仅只是只是“受害者”，而且还能通过其扮演的抗原呈递机制，在炎症相关的肾小球疾病中发挥致病效应[1]。在炎症状态下，足细胞可增加MHC-II分子的表达，通过其表达的免疫球蛋白N型受体清除来自于肾小球基膜(GBM)滤过的免疫球蛋白和(或)免疫复合物。与此同时，足细胞还可通过其表达的TLR介导IL-β、1型干扰素(IFN-1)和NF-κB依赖的细胞因子及趋化因子的释放，并引发炎症细胞的浸润以及免疫介导的组织损伤[10]。而B7-1作为共刺激信号分子，可调高并活化TLR，提高TNF-α的刺激释放T细胞趋化因子的活性，激活效应性T细胞，促进局部趋化因子的释放，其本身在T细胞的活化过程中表达增加[9]。

B7-1介导的足细胞损伤机制尚不明确，目前认为足细胞外端B7-1表达的上调与α3β1整合素的活动状态密切相关[11]。足细胞足突可通过α3β1整合素纵向锚定于GBM，其锚定状态依赖于整合素胞质内尾端与足细胞骨架蛋白的相互作用。研究表明，B7-1胞质内尾端对α3β1整合素活性的阻断是必需的，B7-1的胞质内端可与踝蛋白(talin，细胞骨架相关性蛋白，在细胞膜与细胞骨架相互间起桥蛋白的作用)竞争性结合，干扰整合素尾端与踝蛋白相互作用，从而可介导足细胞的形态学及功能损伤。在培养的足细胞模型，给予CTLA4-Ig处理后，可阻断B7-1对α3β1整合素的作用，并阻止足细胞迁移，而足细胞迁移往往是肾小球滤过屏障受损的病因，在临床上常伴随着蛋白尿的产生。

正是基于足细胞抗原呈递特性的认识以及B7-1在介导足细胞损伤机制的发现，CTLA4-Ig作为特异性蛋白尿控制靶向药物首先应用于难治性或利妥昔单抗抵抗且尿液B7-1阳性的局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者中，取得了蛋白尿缓解的良好效果，并发表于2013的新英格兰医学杂志上[2]。由于B7-1检测技术的局限性，从一开始CTLA4-Ig应用于肾脏病临床治疗就争议不断，但对于CTLA4-Ig的临床应用研究探索的脚步始终没有停止。需要说明的是，目前尚无证据表明足细胞可表达B7-2因此，作为特异性的B7-1抑制剂目前肾科临床CTLA4-Ig制剂主要为阿巴西普。目前阿巴西普在临床应用领域不但包括如MCD和FSGS等肾病综合征[2,12-13]，还包括狼疮性肾病等继发性肾病以及糖尿病肾病等代谢相关性肾病[2]。临床上另一种常用的CTLA4-Ig制剂是巴拉西普(Belatacept)可同时阻断B7-1和B7-2，其器官移植后抗排斥效果优于阿巴西普[14]。巴拉西普对B7-2结合力远高于B7-1，因此临床上并没有作为特异性的足细胞B7-1抑制剂使用。但考虑到非特异性阻断B7-2对整体免疫系统影响，巴拉西普是否其在移植后肾病复发的疗效会更确切，有待进一步临床验证。

CTLA4-Ig在肾脏疾病的研究

FSGS和MCD 目前倾向于将MCD和FSGS看作是与足细胞损害相关同一种疾病的不同发病阶段，MCD通常被视为疾病的早期阶段，而FSGS被认为是足细胞相关疾病的高级阶段[15]。因此就足细胞抗原呈递及CTLA4-Ig在FSGS和MCD中的作用将一并探讨。

临床研究表明，在复发的MCD患者中可观察到尿液中B7-1表达的增加；与之相反在缓解期的MCD和FSGS患者中，尿液中B7-1的水平与正常人相似[12]。该研究引发的疑问在于复发MCD患者中，B7-1产生的细胞来源究竟是什么。该项临床研究人员随后的工作表明，对复发性MCD患者的肾病理切片的免疫组化研究显示，B7-1几乎完全表达于足细胞，而肾小管及间质几乎未见表达[16]。但是该研究并未描述在阳性对及阴性对照组B7-1免疫荧光表达情况。另一项发表于2015年由其他研究组报道的临床结果也表明，在MCD患者尿液中B7-1水平的表达较FSGS患者明显升高。但该文作者未能区分尿液中的B7-1到底是来源于肾脏本身抑或血液[17]。

迄今为止，支持B7-1作为生物标志及治疗靶点的最重要研究发表于2013年的《新英格兰医学杂志》。在该研究中，作者将B7-1拮抗剂阿巴西普成功应用于5例复发或初发的FSGS患者并提出了B7-1介导的足细胞损伤机制[2]。作者认为正常情况下足细胞足突可将α3β1整合素纵向锚定于肾小球基底膜，疾病状态下B7-1的胞质内端可与踝蛋白竞争性结合，干扰整合素尾端与踝蛋白相互作用从而可介导足细胞的形态及功能损伤。CTLA4-Ig通过阻断B7-1胞外段进而可干扰B7-1跨胞浆膜内段，干扰α3β1 整合素与足细胞骨架复合体的锚定结合，籍此可抑制由此启动的疾病发生过程，修复足细胞结构与功能，进而修复肾小球滤过屏障，从而减少蛋白尿的产生。考虑到目前临床对复发性FSGS尤其是肾移植后复发的FSGS治疗选择不多，该研究的结果令人鼓舞，这表明B7-1不但可作为某些肾脏疾病的新兴生物学标志，而且还有可能成为重要的治疗靶点，尤其是那些移植后又复发的FSGS患者。因此在现阶段，旨在验证B7-1作为难治性肾病综合征生物标志可行性及CTLA4-Ig有效性的多中心、随机、前瞻性临床研究计划是不可或缺的[18-19]。

狼疮性肾炎将阿巴西普应用于狼疮性肾炎治疗的设想是基于对药理学机制的认识，通过阻断B7-1-CD28在T淋巴细胞及浆细胞免疫激活中的作用，阿巴西普有可能干预狼疮性肾炎的发病机制，从而发挥治疗效应。早期在鼠类狼疮肾炎模型的研究证实，CTLA4-Ig可阻断甚至于逆转狼疮肾脏损害病理改变[9]。研究表明，在所有WHO狼疮性肾炎病理类型中， Ⅴ型患者的B7-1表达最高；当狼疮性肾炎患者由Ⅱ级转化为Ⅴ型时，其足细胞B7-1的表达会增加，并与蛋白尿程度正相关。临床研究表明(NCT00430677)，阿巴西普可使受试狼疮性肾炎患者的蛋白/肌酐比值下降20%～30%，但并不增加狼疮性肾炎患者的完全缓解率[6]。

糖尿病肾病在细胞培养模型中，给予高糖刺激下，足细胞会高表达B7-1。研究表明，当足细胞暴露于高糖(30 mmol/L)环境中，可观察到时间依赖性的，由PI3K介导的足细胞高B7-1表达，这往往与足细胞特异性突触连接蛋白及α3β1整合素表达的受损有关，同时伴随着细胞骨架蛋白肌动纤维丝的破坏以及细胞活动度的下降[20]。令人关注的是，在培养基中加入CTLA4-Ig，可逆转上述病理损伤的发生。同样，高糖环境下的足细胞B7-1高表达，可诱发足细胞的凋亡及坏死，而预先予以CTLA4-Ig，则可显著减少足细胞的程序性死亡或坏死。在硫脲菌素诱发C57BL/6 1型糖尿病小鼠及2型糖尿病小鼠(db/db)模型中，足细胞B7-1表达的上调同样与蛋白尿的产生及肾功能的受损有关，予以CTLA4-Ig后，则可防止蛋白尿的增加并可减轻肾组织病理学损害。在B7-1敲除的小鼠糖尿病模型中，其蛋白尿产生远远低于野生型糖尿病小鼠，而应用CTLA4-Ig并不能带来进一步的获益，这同样证明B7-1不但在肾脏功能的改变中其重要作用，而且也是CTLA4-Ig取得疗效的重要作用靶点。临床实际中，在合并肾损害的2型糖尿病患者的肾活检病理中，可见足细胞B7-1表达的上调，且表达水平与肾功能损害相关，通常伴随足细胞特异性突触连接蛋白的减少[20]。尽管目前尚无将CTLA4-Ig应用于糖尿病肾病治疗的临床研究正式报道，但鉴于B7-1在糖尿病肾病发病机制所起的作用，尤其是对于临床上仅表现为蛋白尿，而实际上肾功能储备可能处于迅速衰退边缘的2型糖尿病合并肾损害的患者，专注于蛋白尿控制的CTLA4-Ig，在临床实际的应用，将无疑会为是这类人群带来福音[21]。

研究前景和争论目前就各种足细胞相关肾脏病中，B7-1的表达是否为特异性地表达于足细胞，是各方重点关注和争论的焦点，而CTLA4-Ig制剂在肾脏病真实世界中的临床疗效也争议不断。

研究者发现在临床诊断为糖尿病肾病患者中，无论在冰冻的新鲜切片或石蜡包埋切片时，只能发现微量甚或位于肾间质或肾小管细胞的B7-1非特异性表达[22]。早期动物研究表明，给予脂多糖及高糖刺激下，B7-1基因敲除小鼠不会产生一过性的蛋白尿，尽管关于B7-1基因敲除小鼠免疫组化最新研究表明，B7-1基因敲除有可能只是影响了小鼠淋巴结及脾脏的B7-1表达，而肾脏组织中仍然可以观察B7-1的表达[23]。在硫脲菌素诱导的C57BL/6小鼠糖尿病模型，也未能观察到足细胞B7-1的表达[24]。而随后的阿巴西普干预，仅观察到肾脏组织T淋巴细胞浸润的减少，有作者认为这可能有助于减少微量蛋白尿的产生，但阿巴西普对糖尿病整体病情的进展并无明显作用。

同样的疑问也发生在狼疮性肾炎患者，尽管应用了多种替代抗体和免疫组化方法，研究者仍然未能在足细胞观察到B7-1的特异性表达，仅有的微弱表达也只见于肾间质组织中的浸润炎症细胞上[25]。而这种情况同样不但发生于NZB/W狼疮模型小鼠中，也同样于MRI-Faslpr转基因小鼠中[26]。而阿巴西普改善蛋白尿的机制被认为与其拮抗免疫系统B7-1-CD28信号传导途径从而减少免疫细胞的早期活化有关[27]。这也同样被用于解释阿巴西普治疗自身免疫性疾病的疗效机制。

尽管B7-1作为生物标志及治疗靶点的研究已发表于2013年的《新英格兰医学杂志》，但围绕足细胞B7-1的特异性表达及阿巴西普在MCD及FSGS等患者可行性的疑问始终存在。有研究者采该文中所提供的免疫组化技术路线，在反复发作甚至移植后复发的FSGS患者肾脏病理切片上，未发现足细胞B7-1的特异性表达[28]。其他研究者也在复发的FSGS患者，同样未检测到肾小球足细胞B7-1的特异性表达[29]。进一步研究表明即便有某些MCD或膜性肾病患者中可检测到B7-1的表达，而这些无一例外地均不表达在足细胞上，其中大多数表达于肾小管细胞上[28,30]。而阿巴西普在MCD及FSGS临床效果，也只在少数患者MCD观察到蛋白尿的一过性减少，以至于参与实验的研究者认为足细胞B7-1可能在MCD的蛋白尿产生起一定作用，或许在FSGS的复发中根本不起作用[13]。有些研究者发现经脂多糖注射的小鼠及阿霉素诱导的肾病模型小鼠中，也未能观察到足细胞特异性B7-1的表达[31]。鉴于多数关于足细胞特异性B7-1表达的临床研究或动物模型均未能获得阳性的表达，这使许多研究者怀疑发表于2013年的《新英格兰医学杂志》上作者所提出的假设机制是否可行。有研究者认为阿巴西普在某些FSGS患者有效的原因可能与阻断B7-1- CD28共刺激通路，进而阻断由此触发的级联放大信号通路，并最终降低参与FSGS发病的循环致病因子活性有关[32]。

图1 抗原递呈及CTLA4-Ig阻断机制假设示意图[21]A：CTLA4-Ig阻断经典的抗原递呈简图；通过阻断CD28与B7-1结合，CTLA4-Ig可以阻滞T细胞的活化及由此介导的免疫反应，从而表现出免疫调节的作用；B:足细胞抗原递呈及CTLA4-Ig阻断机制假设简图；通过阻断B7-1胞外段进而可干扰其跨胞浆膜内段α3β1整合素与足细胞骨架复合体的锚定结合，CTLA4-Ig可抑制由此启动的疾病发生过程并修复足细胞结构与功能。TCR：T细胞受体；MHC-Ⅱ:主要组织相容性复合物Ⅱ类分子；Paxillin:桩蛋白；Talin:踝蛋白；Actin：肌动蛋白；Synaptopodin:突触连接蛋白；FAK：黏着斑激酶；Cas：Crk相关底物蛋白

小结:足细胞类免疫细胞活性，尤其是抗原呈递特性的发现，对探讨包括狼疮性肾炎、糖尿病肾肾病、MCD、FSGS及膜性肾病等肾小球足细胞疾病的发病机制有重要作用。阻断由足细胞启动的抗原呈递过程，有望为治疗此类疾病的新的途径[33-34]。但围绕足细胞是否能特异性表达B7-1及其与之相关的足细胞疾病发病机制中的作用等疑问持续存在，而回答这些问题将充满挑战。将来寻找并建立切实可行的检测足细胞特异性表达B7-1方法将是至关重要的一步，以此为靶点CTLA4-Ig制剂在以蛋白尿为临床表现的肾脏疾病中的应用，必定要建立在坚实的临床前期工作基础上。