Klotho蛋白对缺血-再灌注肾损伤大鼠氧化应激的影响

木尼热·提力瓦力迪 周 萍 王 顺 李素华

急性肾损伤(AKI)是临床常见的急危重症，发病率高，死亡率高，肾缺血再灌注损伤(IRI)是AKI的主要原因之一。Klotho是高表达于正常肾小管上皮细胞的一种跨膜蛋白，具有抗氧化应激、抗炎症反应和抗衰老作用[1-2]，近些年来一直备受研究者关注。虽然Klotho 有抗氧化应激作用，但是Klotho 能否通过调节NO的合成作用来调节氧化应激作用目前还不清楚。本研究旨通过建立大鼠急性肾缺血再灌注损伤模型，检测 Klotho 干预前后血清NO水平，来探讨 Klotho 对 缺血-再灌注损伤大鼠氧化应激反应的影响及其与NO合成之间的关系。

材料与方法

实验动物3～4月龄健康近交系Wistar 雄性大鼠120只，体质量180～260g(SPF级)由实验动物中心提供，动物分笼饲养，恒温环境下标准化实验日粮饲养，饮水不限。

主要试剂与材料大鼠Klotho ELISA Kit购自武汉华美，人源Klotho蛋白购自赛默飞世尔科技公司，髓过氧化物酶测定试剂盒、总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(WST-1 法)、一氧化氮(NO)测定试剂盒(微板法)购自南京建成，苏木素伊红(HE)染色试剂盒购自碧云天，蛋白预染Marker购自Thermo Scientific，β-巯基乙醇、Tris、SDS、丙烯酰胺、N,N’-亚甲双丙烯酰胺购自Amresco，Anti-Klotho购自Abcam，无水乙醇、二甲苯、中性树脂购自福宇精细化工。

模型建立和实验分组本研究具体分组情况如下：根据随机数字表法将120只大鼠随机分为正常组+生理盐水(NOR+NS,n=24)，假手术+生理盐水组(Sham+NS,n=24)，假手术+Klotho组(Sham+Klotho，n=24)，缺血-再灌注手术+生理盐水组(I/R+NS,n=24)，缺血-再灌注手术+Klotho组(I/R+Klotho,n=24)。NOR+NS组:不开腹，仅腹腔内注射麻醉剂(戊巴比妥钠)麻醉大鼠和注射NS。Sham+NS与Sham+Klotho组：常规消毒手术器械、准备无菌手术台,2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后，备皮并消毒手术野。麻醉状态下从耻骨联合上方1 cm至剑突下方正中切开腹部，将肠管翻至腹腔外，用湿纱布包裹保护，暴露双侧肾脏，切除右侧肾脏,不夹闭左侧肾蒂，将Klotho蛋白(0.01 mg/kg)或NS(同等容量)腹腔注射。I/R+Klotho与Sham+Klotho组：常规消毒手术器械、准备无菌手术台,2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后，备皮并消毒手术野，同法切除右侧肾脏,左侧肾动脉钝性分离，用无创动脉夹靠近肾门处夹闭肾动脉，观察肾脏由鲜红色逐渐变为暗红色，将腹腔外肠管还纳至腹腔内，用血管钳钳夹腹壁，夹闭腹腔，以防止水分散失和体温下降，45 min后去除血管钳，打开腹腔，将腹腔内肠管翻至腹腔外，暴露肾脏，松开动脉夹，恢复肾脏血液灌流，肉眼可见肾动脉充盈，肾脏逐渐由暗红色变为鲜红色，表明再灌注成功。用1号细丝线连续缝合腹壁切口。术后大鼠放于24℃～29℃环境，紧密观察大鼠的生命体征，同时补充水与饲料，造模成功后将Klotho蛋白(0.01 mg/kg)或NS(同等容量)腹腔注射。

模型成功判定密切观察肾脏，松开动脉夹以后从紫黑色逐渐变为红色说明经过缺血一再灌注病理生理过程，关腹继续观察2h，如实验动物能正常活动说明造模成功；如果松开动脉夹5 min后，肾脏未转变红色，则认为再灌注造模未成功，本实验造模成功率为88%。

实验指标检测

标本收集 五组分别在造模成功后1h、5h、12h及24h 4个时间点，各组各时间点分别随机选出6只大鼠处死，从腹正中线皮肤切开腹腔，使腹主动脉清楚暴露。用注射器吸出静脉血液，编号后静置2h，3 000 r/min离心10 min，常规分离血清并置于-80℃冰箱保存。于上述4个时间点处死大鼠后，迅速剥离大鼠的肾脏，记录其肉眼外观，然后每侧肾各取1块组织置于10%的中性甲醛中4℃固定过夜，标本待测。

肾功能检测 血清肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)采用美国Backman全自动生化检测仪检测。

大鼠肾组织中过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)的表达 采用比色法检测组织MPO、组织SOD活性及血浆NO含量，检测按试盒进行，严格按试剂盒说明说操作进行检测。

血浆Klotho蛋白 NOR+NS，Sham+NS,I/R+NS三个组采用ELISE法检测Klotho蛋白水平。

肾脏病理检查 已固定肾组织经脱水、透明、浸蜡和包埋等步骤制成蜡块后制作切片，染色前切片常规脱蜡入水，最后行HE染色。

统计学处理数据应用SPSS 14.0进行统计学分析，实验所有数据均用表均值±标准差表示，两组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

大鼠肾脏病理学改变缺血-再灌注损伤以后各实验组各时间段大鼠肾脏组织呈现不同的改变，其中造模成功后24h改变最显著。NOR+NS组镜下肾小管未见明显异常，肾皮质区个别肾小管轻度扩张，个别管腔内见红染无结构蛋白管型样结构；肾小球未见明确异常;Sham+NS组镜下见皮质区个别肾小管扩张，部分肾小管上皮水肿，空泡变性；肾小球未见明确异常;I/R+NS组镜下见皮质区及皮髓交接区部分肾小管刷状缘消失，较多肾小管上皮细胞水肿，空泡变性，部分肾小管上皮核固缩，胞质红染，凝固性坏死，脱落，管型形成；间质未见明确炎症反应；肾小球未见明确异常;Sham+Klotho组镜下部分肾小管上皮空泡变性；肾小球未见明确异常;I/R+Klotho组镜下部分肾小管上皮空泡变性，并见少部分肾小管上皮坏死、脱落及管型形成；肾小球未见明确异常。

外源性补充Klotho蛋白对缺血再灌注前后SCr及BUN的影响实验结果显示NOR+NS组和Sham+NS组血清SCr水平及BUN水平各时间点无明显变化，I/R+NS组血清SCr 1h～12h持续增高，并12h达到高峰，BUN水平也有持续增高趋势，并24h达到高峰，与NOR+NS组和Sham+NS组相比明显增高(P<0.01)，I/R+Klotho组血清SCr及BUN水平1h～12h持续增高趋势，但与I/R组相比增高趋势缓慢，各时间点SCr水平及BUN水平与I/R+NS组相比明显下降(P<0.01)(图1)。

图1 血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)的动态变化相同时间点内各组间比较，NOR+NS组:AP<0.01,aP<0.05;各组比较,I/R+NS组:bP<0.05,BP<0.01;同一组内不同时间点比较1h:EP<0.01；NOR+NS：正常+生理盐水组；Sham+NS:假手术+生理盐水组；I/R+NS：手术+生理盐水组；Sham+Klotho:假手术+Klotho组；I/R+Klotho:手术+Klotho组

Klotho蛋白表达的动态变化NOR+NS组及Sham+NS组Klotho蛋白表达水平各时间点无明显变化，I/R+NS组Klotho蛋白表达水平逐渐减少，差异有统计学意义(图2)。

图2 Klotho蛋白表达的动态变化A:相同时间点内各组与NOR+NS组比较，P<0.01；NOR+NS：正常+生理盐水组；Sham+NS:假手术+生理盐水组；I/R+NS：手术+生理盐水组

肾组织MPO的动态变化NOR+NS组和Sham+NS组MPO含量各时间点无明显变化，I/R+NS组随着再灌注时间的延长MPO含量逐渐增高，与1h MPO含量相比差异有统计学意义(P<0.01)，各时间点MPO含量与NOR+NS组和Sham+NS组相比明显增高(P<0.01)，I/R+Klotho组MPO含量随着时间的延长仍有升高趋势，但与I/R+NS组相比升高趋势缓慢，各时间点MPO含量与I/R+NS组相比明显减少(P<0.01)(图3)。

肾组织SOD水平的动态变化NOR+NS组和sham+NS组SOD含量各时间点无明显变化，I/R+NS组SOD水平1h～24h呈逐渐下降趋势，各时间点SOD水平与NOR+NS组和Sham+NS组相比显著减少(P<0.01)，I/R+Klotho组血清SOD水平仍有逐渐下降趋势，但与I/R+NS组相比下降趋势缓慢，各时间点SOD含量与I/R+NS组相比明显增高(P<0.01)(图3)。

图3 肾组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(MPO)的动态变化相同时间点内各组间比较NOR+NS组AP<0.01,aP<0.05;比较I/R+NS组bP<0.05,BP<0.01;同一组别不同时间点比较1h,EP<0.01;NOR+NS：正常+生理盐水组；Sham+NS:假手术+生理盐水组；I/R+NS：手术+生理盐水组;Sham+Klotho:假手术+Klotho组;I/R+Klotho手术+Klotho组

血浆NO浓度的动态变化NOR+NS组血浆NO水平1h～12h无明显变化，24h明显降低，sham+NS组NO水平5h明显下降，与1h相比差异有统计学意义(P<0.01)，但24h NO含量明显增高，与5h相比差异有统计学意义(P<0.01)，I/R+NS组NO水平1～24h逐渐下降趋势，各时间点NO含量与Norm+NS组和Sham+NS组相比显著降低(P<0.01)，I/R+Klotho组NO含量1～24h仍有逐渐下降趋势，但与I/R+NS组相比下降趋势缓慢，各时间点NO水平与I/R组明显增高(P<0.01)(图4)。

图4 血浆一氧化氮(NO)浓度的动态变化相同时间点各组间比较NOR+NS组AP<0.01；同组内不同时间点比较1h，EP<0.01;NOR+NS：正常+生理盐水组；Sham+NS:假手术+生理盐水组；I/R+NS：手术+生理盐水组；Sham+Klotho:假手术+Klotho组;I/R+Klotho手术+Klotho组

讨 论

AKI目前仍是一个与高发病率和高死亡相关的严重医学问题，如何能有效改善患者肾缺血，改善氧化应激一直是研究者追寻的结果[3]。 AKI是十分复杂的病理生理过程，其发病机制可能涉及肾缺血再灌注损伤、炎症因子、NO学说、细胞 凋亡学说、内皮功能障碍及内皮素作用、内毒素直接损伤、氧化应激损伤等[4]。据文献记载， NO的产生对缺血预处理大鼠的肾脏有积极的影响，抑制NO合成增加了肾脏对缺血再灌注损伤的易感性[5-6]。

本研究通过切掉大鼠右侧肾脏，夹闭左侧肾蒂建立大鼠缺血-再灌注模型，而后给予Klotho蛋白干预。结果显示随着再灌注时间的延长BUN及SCr含量持续增高，与NOR+NS组和Sham+NS组相比明显增高，提示缺血-再灌注后，大鼠肾脏受损、肾功能显著受损，肾组织形态学检查亦显示皮质区及皮髓交接区部分肾小管刷状缘消失，较多肾小管上皮细胞水肿，空泡变性，部分肾小管上皮核固缩，胞浆红染，凝固性坏死，脱落，管型形成，均表明I/R模型制作成功。

当细胞被有害因素刺激时，产生大量的活性氧，氧化和抗氧化系统之间的平衡被破坏，最终发生氧化应激，促进细胞凋亡甚至病理损伤。大量研究表明，许多肾脏疾病模型处于氧化应激状态，因此本研究通过检测肾组织MPO及SOD含量以判定大鼠IRI模型的氧化应激反应。其中MPO是一种过氧化物酶，为髓系细胞杀菌系统的重要组分，同时也是氧化应激的一个主要标志物[7]，本研究得出I/R+NS组随着再灌注时间的延长MPO含量逐渐增高，并各时间点MPO含量与正常对照组及假手术组相比明显增高，提示缺血再灌注后肾组织中性粒细胞聚集，参与肾脏的损伤；而SOD作为一种抗氧化酶，可以抵抗机体受氧化损伤，其活性高低也可反映机体抗体抗氧化能力[8]。本实验结果提示I/R+NS组随着再灌注时间的延长，SOD水平明显减少，并各时间点的SOD含量与对照组相比明显减少提示缺血再关注后产生大量ROS，导致抗氧化物质SOD的大量消耗。以上均表明IRI损伤中氧化应激参与肾组织的损伤。

尽管Klotho在多个器官中表达，但它在肾脏中高表达，特别是在远曲小管中[9]，大量研究证实Klotho蛋白具有抗氧化，抗凋亡，抗衰老等功能[9-11]，而后Hu等[12]发现IRI大鼠的肾脏，尿液和血液中的Klotho减少，损伤修复后恢复正常。提示Klotho蛋白缺失参与AKI发生发展的病理生理过程。本研究结果显示:IRI以后，Klotho蛋白含量明显减少，结果与Hu等[12]的实验结果相符，Klotho蛋白干预后IRI大鼠SCr水平及BUN明显减少、病理组织学也显示肾组织损伤程度减轻，提示Klotho蛋白有肾脏保护作用，通过实验我们还证实Klotho干预以后肾组织MPO含量减少，SOD含量增多，考虑Klotho蛋白肾脏保护作用与其抗氧化作用密切相关。

NO作为一种血管舒张因子．可以降低肾脏血管阻力、改善肾脏血液灌注，保证肾脏代谢及排泄功能的正常运行，NO浓度的适当升高，是AKI中一个重要的保护因素。研究表明，Klotho蛋白具有抗氧化应激作用，Klotho能否通过调节NO的合成及其活性改善急性肾损伤的肾脏灌注目前未见相关报道。我们得出的实验结果显示：NOR+NS组损伤12h之前NO含量无明显变化，Sham+NS组5h明显下降，但24h NO含量明显增高，提示单纯手术对NO含量无明显影响，单群手术以后机体通过自我调节能提高NO含量；I/R+NS组NO水平随着再灌注时间的延长逐渐下降趋势，各时间点NO含量与NOR+NS组和Sham+NS组相比明显降低，NO水平的下降与肾脏形态结构损伤及功能损害程度相符，均说明缺血-再灌注损伤中体内NO含量下降可能为肾脏损伤过程中不可忽视的环节；Klotho蛋白干预后NO含量明显增高，肾脏功能及形态学损伤有明显的恢复，考虑Klotho蛋白的肾脏保护作用可能与其通过增加NO含量来扩张肾脏血管及改善肾脏血供密切相关。

综上所述，I/R后，大鼠肾脏组织形态及功能均发生损伤，氧化应激参与此过程，Klotho蛋白通过抵抗过度氧化应激减轻肾缺血-再灌注损伤，其作用可能与调节NO合成密切相关，Klotho蛋白促进NO合成的具体作用机制还需进一步研究。