骨髓增殖性肿瘤患者发生血栓事件的危险因素*

郭晓波，杨 乐，蔺 京，龚卫锋，杨瑞利，史 敏

1.西安市中心医院(西安 710003)；2.西安长安医院(西安710018)；3.西安培华学院医学院(西安710061)

骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferative, MPN)包括真性红细胞增多症，原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化是起源于造血干细胞水平的克隆性血液恶性肿瘤。MPN发病机制的核心是由于影响JAK2，CALR或MPL的驱动突变家族的JAK / STAT信号传导途径的组成活化，炎症因子被活化后可以引起红系、巨核系异常增殖，网状纤维异常增生，胶原蛋白过度沉积，从而又引发外周血细胞过度增生，骨髓纤维化和髓外造血等临床表现[1]。这些疾病发病较为隐匿，进展缓慢，患者早期可能无任何临床症状，仅在做血常规检查时偶然发现，其具有共同的临床和实验室特征，是一系或多系统血细胞增多，肝脾肿大，有出血和血栓形成，发生动脉和静脉血栓形成事件的风险增加以及进展为骨髓纤维化和急性白血病的可能性，并且以血栓性并发症的高发生率而闻名[2]。一些研究表明MPN发生血栓性并发症与JAK2-V617F突变有很大的相关性[3]。本研究主要对MPN血栓事件发生率与JAK2-V617F等一些临床指标进行分析，探讨引发血栓事件的危险因素，为临床提供有益帮助。

资料和方法

1 一般资料 所有病例均来自本院就诊住院MPN患者，其中男195例，年龄15～72岁，平均年龄56岁；女196例，年龄16～60岁，平均年龄48岁。391例病例的诊断均符合最新WHO关于骨髓增殖性肿瘤的分类和诊断的标准[4]。

2 仪器与试剂 JAK2-V617F采用美国伯乐CFX96实时荧光定量PCR仪，RNeasy Plus Mini Kit提取试剂盒购自德国GIAGEN公司，融合基因试剂盒(JAK2-V617F)购自上海源奇生物医药科技股份有限公司。血细胞分析仪采用迈瑞BC-5800，试剂为其公司试剂。

3 检测方法

3.1 血常规外周血采集：所有对象从肘正中静脉抽取静脉血2ml置于EDTAK2抗凝管中，立即混匀，室温2 h内进行测定。标本测定前需用标准血浆对血细胞仪进行室内质量控制，要求在控。在本研究当之中主要是针对白细胞计数、血小板计数以及血红蛋白浓度值进行了对比分析。

3.2 JAK2-V617F融合基因标本采集和检测：采集患者外周血5.0m加入EDTAK2作为抗凝剂的一次性试管中，颠倒混匀，通过红细胞裂解液除去标本中的红细胞(红细胞破裂，液体呈红色透明状)，获得白细胞，进而裂解白细胞和去除蛋白，用RNA提取试剂从中获得RNA。将混有引物和荧光探针等物质的PCR反应液与酶混合，震荡混匀5～10 s，在迷你离心机快速离心，从而将管壁和盖子上的液体甩至管底。将上述液体放于PCR八连管中，随后将提取好的样本、内参、阴阳对照、标准品分别加入对应管内，盖紧管盖、将其移至检测区。反应管置于实时荧光定量PCR仪上，按实际说明书要求设置相应的循环参数：45℃×5min→95℃×3min，再按94℃×15s→60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃；检测通道为FAM通道。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定性分析，一般的Ct值可选择在全部扩增曲线的第一个明显拐点前2～3个Ct值，设定3～15个循环的平均荧光信号为基线(图1)。全部实验操作过程均严格按照试剂说明书和实验室操作规范进行，同时做质量控制，所有的结果均在实验室质量控制范围内。

注：Amplification为扩增曲线，Cycles为循环数，Log Scale为对数范围

3.3 血栓性事件调查 通过经验丰富的临床医师对患者进行既往病史调查，详细询问并且记录每一位患者既往有无心、脑血栓性疾病以及出现和MPN拟诊相关临床征象后的深静脉血栓形成和心、脑梗死等血栓性事件发生的情况。

4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件分析处理数据，计数资料用[例(%)]表示，计量资料比较采用χ2检验。以发生血栓事件为因变量，各项记录指标为自变量，进行多因素Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1 MPN血栓事件发生率的情况 391例MPN患者中105例发生血栓事件，血栓发生率为26.9%(105/391)。血栓发生率在男女性别之间差异无统计学意义(χ2=0.59，P>0.05)；而年龄≥45岁的患者高于年龄<45岁的患者，差异有统计学意义(χ2=16.81，P<0.05)；JAK2-V617F阳性的患者高于阴性患者，差异有统计学意义(χ2=23.59，P<0.05)；外周血白细胞数量≥10×109/L的患者高于白细胞<10×109/L的患者差异有统计学意义(χ2=28.3，P<0.05)；外周血血小板数量≥300×109/L的患者高于血小板数量<300×109/L的患者，差异有统计学意义(χ2=29.14，P<0.05)；外周血血红蛋白含量≥160g/L的患者高于血红蛋白含量<160g/L的患者，差异有统计学意义(χ2=30.58，P<0.05)。见表1。

表1 MPN血栓事件发生率情况

2 Logistic回归分析 采用多因素Logistic回归分析方法，以年龄、性别、白细胞、血小板、血红蛋白、JAK2-V617F阳性为自变量，以血栓为因变量，结果显示：高龄、高白细胞计数、高血小板计数、高血红蛋白含量、JAK2-V617F突变阳性是血栓事件发生的危险因素，见表2。

表2 多因素Logistic回归分析结果

讨论

骨髓增殖性肿瘤患者的整个发病的过程中出现的所有并发症以及继发血液系统癌症,是对这一类患者的生存质量有非常大的影响。由于这一类患者外周血中的细胞增殖速度过快、量过高，以至于引起外周血液粘稠、淤滞，进而又引起心脑血管方面的各种疾病，心脑血管血栓和出血事件是这一类患者出现并发症以及于导致此类患者死亡的最主要原因之一。2016年新的骨髓增殖性肿瘤诊断标准中，JAK2-V617F基因突变检测被纳为诊断标准之一，真性红细胞增多症患者JAK2-V617F基因突变的检出率为90%～95%，原发性血小板增多症患者JAK2-V617F基因突变的检出率为50%～70%，原发性骨髓纤维化患者JAK2-V617F基因突变的检出率为40%～50%。JAK2-V617F基因突变不仅与骨髓增殖性肿瘤的发生、发展有关，而且与其并发症和预后也有很大关系，有研究表明，JAK2-V617F基因突变可以增加费城染色体阴性MPN患者心血管并发症的风险[5]。同时也有研究表明JAK2-V617F突变与血栓事件的发生率之间存在显着的相关性，JAK2-V617F内皮细胞有促炎症和促血栓表型和功能上都是亲粘附，提示这些突变可能在血栓形成中发挥作用[6-8]。Lamy M等国外研究者在其研究结论中，认为筛选在CVT患者JAK2 -V617F突变似乎即使没有明显的MPN和/或由于其患病率比较高的其他危险因素CVT的存在和血栓复发的危险性是有益的[9]。

本文从MPN患者性别、年龄、JAK2-V617F、外周血常规方面，分别比较其血栓事件的发生率，结果显示MPN患者男女性别之间，差异无统计学意义，而高年龄、JAK2-V617F阳性、高白细胞数量、高血小板数量、高血红蛋白含量的患者更易出现心脑血管血栓事件。本研究还进一步通过回归分析显示，高年龄、高白细胞计数、高血红蛋白含量、高血小板计数、JAK2-V617F突变等因素与MPN发生血栓事件有关，是发生血栓事件的危险因素。此次研究结果中，JAK2-V617F阳性患者血栓发生率为80%，阴性患者血栓发生率为20%，两组间比较差异有统计学意义，这一结果与土耳其研究者Andlc Neslihan 的研究结果有相似之处[10]。国内研究者吴鸿飞等[11]人回顾性分析了115例bcr-abl阴性的骨髓增殖性肿瘤患者初诊时的临床特征和实验室指标，最终认为JAK2-V617F阳性、高HB水平、高血压、高龄是发生血栓的危险因素，这一结果中有些观点与本文研究结论相一致。

血栓是骨髓增殖性肿瘤患者主要致死和致残的原因之一，所以预防和治疗血栓发生是治疗这一类疾病的主要目的。目前临床上主要的治疗方法有小剂量阿司匹林降低原发性真性红细胞增多症和原发性血小板增多症患者的血栓发生，针对原发性真性红细胞增多症的放血疗法，羟基脲、干扰素α降低血细胞的方法。对于原发性血小板增多症的患者可以适当的采用抗凝剂药物治疗来防止血栓的发生。原发性骨髓纤维化患者主要是激素、沙利度胺、骨化三醇、纠正其贫血等手段为主，如遇到早期血细胞高的患者可以加羟基脲进行治疗[12]。近年来JAK2抑制剂[13-14]等一些新型靶向药物的研究有望对JAK2-V617F阳性的患者带来更多选择和新的曙光。对于本研究当中引发骨髓增殖性肿瘤患者血栓事件的危险因素，临床及早的采取一些预防和治疗措施，可以帮助患者提高生活质量和延长生存期。

综上所述，血栓形成在癌症患者中很常见，并与发病率和死亡率增加有关，骨髓增生性肿瘤(MPN)最重要的并发症是血栓栓塞事件，因此预防血栓形成事件是目前这些疾病治疗的主要目标。年龄较高、JAK2-V617F阳性、血细胞升高的MPN患者容易出现血栓事件，是其发生血栓事件的危险因素，提示临床对于这些指标的变化应该引起高度重视，及早采取预防措施。