血清miR-181b、miR-210 表达与妊娠期高血压疾病患者炎性因子的关系

任 娜 季景环

河北省沧州市人民医院妇产科，河北沧州 061000

妊娠期高血压疾病（HDP）是妊娠期妇女的常见疾病，在我国发病率为5%～10%，以高血压和蛋白尿为主要特征，是仅次于产后出血导致孕产妇死亡的原因［1］。HDP 发病机制尚不完全清楚，早期诊断并评估病情的严重程度，是临床制订有效干预方案，减少HDP病情进展的重要手段。微小RNA（miR）是一类高度保守的非编码小分子RNA，长度为21～23 个核苷酸，参与调控细胞的增殖、生长、分化、凋亡、免疫应答、恶性肿瘤的发生发展等生理病理过程［2］。miR-181b、miR-210是常见的miR 分子，主要参与缺血性脑卒中等疾病的发病过程［3］，但其在HDP 发病过程中的作用相关报道较少。研究［4］发现，HDP 发生发展过程中，炎症细胞合成、炎性因子分泌贯穿整个环节。本研究通过检测血清miR-181b、miR-210 水平，旨在探讨其与HDP 患者的表达水平及与炎性因子的关系。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016 年1 月～2018 年1 月河北省沧州市人民医院（以下简称“我院”）收治183 例HDP 单胎孕妇为病例组，同期选取55 名健康孕妇为对照组。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。根据HDP 诊断与分类标准［5］将病例组分为3 个亚组，妊娠期高血压亚组51 例，轻度子痫前期亚组79 例，重度子痫前期亚组53 例。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者及家属均知情且签署知情同意书。

纳入标准：①符合《妇产科学》（第7 版）［5］中关于HDP 的诊断与分类标准；②单胎妊娠孕妇；③规律产检，临床资料完整者。排除标准：①心脏功能不全者；②肝、肾功能障碍者；③双胎及以上者；④合并妊娠期糖尿病者；⑤急慢性炎性反应疾病者；⑥自身免疫性疾病者；⑦母体或胎儿为艾滋病或病毒阳性者；⑧胎儿先天性畸形的孕妇；⑨合并其他可能影响本研究结果的疾病。

表1 两组基线资料比较（±s）

表1 两组基线资料比较（±s）

1.2 方法

1.2.1 血清miR-181b、miR-210 相对表达量检测

1.2.1.1 主要试剂和仪器 RNA 提取试剂盒（美国Invitrogen公司，生产批号：20151126），美国Invitrogen 公司提供的PrimeScript® RT reagent Kit（生产批号：20150923）和QuantiFast® SYBR® Green Pcr Kit（生产批号：20151107），引物（上海捷瑞生物工程有限公司），5415R 型小型低温高速离心机（德国Eppendorf公司），C1000 型Bio-Rad PCR 仪（美国BIORAD 公司），UV1900PC 型紫外分光光度计（常州三丰仪器科技有限公司）。

1.2.1.2 血清miR-181b、miR-210 检测 提取RNA：抽取两组肘静脉血5 mL，常温下静置30 min 后，3000 r/min离心10 min，离心半径为12 cm，取血清置于-80℃环境下保存。血清中加入1 mL Trizol RNA，提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA 总纯度，比值在1.8～2.0，说明样本合格。反转录试剂盒将总RNA 反转录为cDNA，miR-181b 正向引物序列：5′-AACATTCATTGCTGTCGGTGGG-3′，反向引物序列：5′-GCGAAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3′，长度为78 bp；miR-210正向引物序列：5′-CAATAACTGTGCGTGTGACAGC-3′，反应引物序列：5′-TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3′，长度为77 bp；内参基因U6 正向引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，长度为70 bp。反转录的反应体系为20 μL，包括内参基因U6 3 μL 和miR 特异性茎环引物，模板RNA 5 μL，100 mmol/L 的dNTPs 0.15 μL，50 U/μL 的反转录酶1.0 μL，20 U/μL的RNase 抑制剂0.19 μL，10×反转录缓冲液1.5 μL，无菌不含酶的蒸馏水4.16 μL。逆转录条件：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，10 min；将提取的cDNA 在4℃的冰箱中保存。qRT-PCR 法：以cDNA 为模板，建立20 μL qRT-PCR反应体系，包括2×定量PCRMasterMix10μL，引物及探针Mix 1 μL，cDNA 模板1.33 μL，无核酸酶的蒸馏水7.67 μL。反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性12 s，60℃复性40 s，72℃延伸20 s，持续40 个循环。实验重复3 次后取平均值，计算miR-181b、miR-210 相对表达量，以2-△△Ct表示，△Ct=Ct（miR-181b/miR-210）-Ct（U6）。

1.2.2 血清炎性因子水平检测

酶联免疫吸附法检测血清白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-10、IL-17 及肿瘤坏死因子-α（TNF-α），操作过程严格按照试剂盒（上海科新生物技术股份有限公司，批号：20151023、20150609）说明进行。

1.3 统计学方法

采用SAS 9.4 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验，两组间比较采用t 检验；计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson 积矩相关分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-181b、miR-210 及炎性因子水平比较

病例组血清miR-181b、miR-210 及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 水平均高于对照组，IL-10 水平低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

2.2 不同HDP 亚组血清miR-181b、miR-210 及炎性因子水平比较

不同HDP 亚组血清miR-181b、miR-210 及IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α 比较，差异均有统计学意义水（均P＜0.05）；轻度子痫前期亚组miR-181b、miR-210 及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 高于妊娠期高血压亚组，IL-10 低于妊娠期高血压亚组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；重度子痫前期亚组miR-181b、miR-210 及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 高于轻度子痫前期亚组，IL-10 低于轻度子痫前期亚组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。

表2 两组血清miR-181b、miR-210 及炎性因子水平比较（±s）

表2 两组血清miR-181b、miR-210 及炎性因子水平比较（±s）

注：miR-181b：微小RNA-181b；miR-210：miR-210；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-6：白细胞介素-6；IL-10：白细胞介素-10；IL-17：白细胞介素-17；TNF-α：肿瘤坏死因子-α

表3 不同HDP 亚组血清miR-181b、miR-210 以及炎性因子水平比较（±s）

表3 不同HDP 亚组血清miR-181b、miR-210 以及炎性因子水平比较（±s）

注：与妊娠期高血压亚组比较，*P＜0.05；与轻度子痫前期亚组比较，#P＜0.05。miR-181b：微小RNA-181b；miR-210：微小RNA-210；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-6：白细胞介素-6；IL-10：白细胞介素-10；IL-17：白细胞介素-17；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；HDP：妊娠期高血压疾病

2.3 Pearson 积矩相关分析

HDP 患者血清miR-181b 与IL-1β（r=0.722，P＜0.01）、IL-6（r=0.759，P＜0.01）、IL-17（r=0.713，P＜0.01）、TNF-α（r=0.736，P＜0.01）呈正相关，与IL-10（r=-0.781，P＜0.01）呈负相关。HDP 患者血清miR-210 与IL-1β（r=0.765，P＜0.01）、IL-6（r=0.793，P＜0.01）、IL-17（r=0.738，P＜0.01）、TNF-α（r=0.772，P＜0.01）呈正相关，与IL-10（r=-0.745，P＜0.01）呈负相关。

3 讨论

HDP 是仅在妊娠期发生的严重并发症，多数患者病情较轻，少数严重患者可出现抽搐、昏迷、心力衰竭、肾功能不全以及胎盘早剥等严重并发症，严重者可致死亡［6］。HDP 发病机制复杂，是遗传因素、免疫失衡、血管内皮细胞损伤、滋养细胞缺血等多种因素共同作用的结果［7］。miR 是在真核生物中广泛存在且在组织中的表达具有特异性的内源性非编码RNA，可发挥抑制目标miR 分子翻译活性的功能［8］。研究［9］显示miR 介导细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫应答过程，同时参与激素的分泌及神经发育、恶性肿瘤细胞的发生发展等病理生理过程。

miR-181b 参与中枢神经系统疾病、心血管疾病、免疫性疾病以及恶性肿瘤的发病。Zhang 等［10］发现，miR-181b 在癫痫持续状态的大鼠模型海马组织中呈低水平表达，并且通过Notch 信号通路，对抗凋亡基因Nrarp 起到负调控作用。苏显都等［11］发现，miR-181b表达上调介导精神分裂症发病过程，可作为评估精神分裂症患者病情改善、治疗效果及预测预后的潜在靶向指标。Sun 等［12］通过动物实验证实，小鼠炎性反应过程及血管内皮损伤时血清miR-181b 表达异常，由此推断其参与动脉粥样硬化过程。姚育红等［13］证实，miR-181b 作为促癌基因在胃癌组织中表达上调，并与恶性肿瘤的侵袭和转移密切相关。miR-210 基因位于人体11 号染色体上，属于缺氧激活因子，当机体出现缺血缺氧时，组织miR-210 表达上调，促进新生血管的形成［14］。Ma 等［15］在构建缺血缺氧性脑损伤大鼠模型中增加miR-210 模拟物，大鼠脑水肿明显加重，而抑制miR-210 表达则可减少脑损伤，miR-210 在新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的神经保护中发挥重要功能。齐京鹏等［16］发现，miR-210 通过调控靶基因介导胃癌的发病过程，有望成为诊断胃癌的靶向指标。陆芸瑶等［17］证实，乳腺癌患者恶性肿瘤细胞不断增殖形成缺氧环境，激活组织中miR-210 的表达。另有研究［18］显示，miR-210 参与缺血性脑卒中后的炎性反应过程，还与子痫前期的发病密切相关。

本研究结果显示，miR-181b、miR-210 在HDP 患者中表达上调，随着HDP 病情严重程度的增加，其表达水平上调明显，提示miR-181b、miR-210 参与了HDP 发病过程。此外，病例组血清促炎因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 水平显著高于对照组，抑炎因子IL-10 低于对照组，并且病情越重，促炎因子水平越高，抑炎因子水平越低，与马彩莲等［19］研究结果相似。HDP 发病时诱导机体释放大量促炎因子，激活炎性反应，损伤血管内皮细胞，使血管通透性增加，脏器缺氧缺血；IL-10 作为抑炎因子，可使机体的免疫反应降低，使促炎因子合成并分泌。多种炎性因子通过级联反应破坏胎盘细胞因子间的动态平衡，进而参与HDP 整个发病过程。因此，早期检测炎性因子有助于临床评估HDP 病情严重程度。

Pearson 积矩相关分析发现，HDP 患者血清miR-181b、miR-210 与IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 呈正相关性，与IL-10 呈负相关性，提示miR-181b、miR-210可能通过介导炎性反应过程而参与HDP 发病过程。miR-181b 在内皮细胞NF-κB 信号通路介导的炎性反应过程中发挥重要作用，促进促炎因子的合成和释放，加重血管炎性反应，损伤血管内皮细胞，最终参与HDP 发病［20］。miR-210 作为缺氧激活因子，通过相应靶位可激活相应信号通路，促进机体发生氧化应激反应，导致免疫调节紊乱，诱发促炎因子大量释放，抑制抑炎因子释放，最终参与HDP 发病过程［21］。

综上所述，miR-181b、miR-210 通过介导炎性因子的释放而参与HDP 发病过程，并且与病情严重性密切相关。