耐药结核分枝杆菌与耐药基因突变的相关性分析

孔伟伟，邢应如，胡万发，胡 东，吴 璇，于 莉，汪旻旻，黄升海

在医学迅速发展的今天，全球仍有约1/3人口受过结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染，且每年都有新增病例，相关研究[1]显示，我国是全球22个结核病高负担国家之一。传统的MTB培养耗时长，实验本身也存在一些问题，已经不能满足临床诊治的需要[2]。随着分子生物学的发展，MTB耐药分子机制被进一步阐明。研究[3]表明，MTB耐药的主要机制是基因突变，结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变可能分别与MTB耐受利福平(rifampin，RFP)、异烟肼(isoniazid，INH)、链霉素(streptomycin，SM)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)和乙胺丁醇(ethambutol，EMB)密切相关。为了获得MTB耐药性特征，该实验用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测MTB临床分离株的rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变，并和常规药敏实验(drug sensitive test，DST)做对照，进一步探讨MTB耐药性与耐药基因之间的关系，为临床用药提供更多的指导。

1 材料与方法

1.1菌株来源收集安徽医科大学第一附属医院和安徽理工大学附属肿瘤医院共68例临床耐药株肺结核患者痰标本，结核分枝杆菌H37Rv ATCC27294为MTB药物敏感试验质控菌株，H37Rv ATCC35822为异烟肼耐药质控菌株，H37Rv ATCC35838为利福平耐药质控菌株，H37Rv ATCC35820为链霉素耐药质控菌株，H37Rv ATCC35828为吡嗪酰胺耐药质控菌株，H37Rv ATCC35837为乙胺丁醇耐药质控菌株，均由卫生部生物制品鉴定所提供。

1.2MTB鉴定和药敏罗氏培养基购自珠海贝索生物技术有限公司(批号：20161128)，培养基内不同药物浓度含量如下：RFP高浓度250 mg/L，低浓度25 mg/L；INH高浓度10 mg/L，低浓度1 mg/L；链霉素SM高浓度100 mg /L，低浓度10 mg/L；PZA高浓度250 mg/L，低浓度50 mg/L；EMB高浓度50 mg/L，低浓度5 mg/L。MTB基因鉴定与耐药基因检测试剂盒(批号T201709001)购自深圳亚能生物基因研究所。

1.3PCR-SSCP检测方法患者痰标本经NaOH液化、离心等前处理后，经Bactec-960仪快速培养后，培养阳性标本经涂片染色确定为抗酸分枝杆菌并做罗氏药敏实验，耐药性测定方法和耐药标准判断按照“全国结核病细菌学检验标准化规程”进行。挑取耐药MTB菌株培养物，提取DNA，-20 ℃保存备用。PCR扩增：在25 μl反应体系中，4×dNTP的终浓度为0.2 μmol/L，引物Ⅰ、Ⅱ的终浓度分别为0.3 μmol/L，纯化的DNA模板5～25 ng，TaqDNA聚合酶1 U，在DNA热循环仪中，按94 ℃变性50 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，扩增35个循环，最后在72 ℃延伸7 min，取3 μl扩增产物在2 %琼脂糖凝胶中电泳检测扩增产物，可分别扩增MTB耐利福平基因(rpoB)产生232 bp片段；耐异烟肼基因(katG)产生273 bp片段；耐链霉素基因(rpsL)产生267 bp片段；耐吡嗪酰胺基因(pncA)上游产生282 bp片段，下游产生248 bp片段；耐乙胺丁醇基因(embB)产生365 bp片段。耐药基因完全缺失，PCR扩增为阴性。将临床分离株与MTB标准株的DNA-PCR扩增产物加在同一块8%(29 ∶1)非变性聚丙烯酰胺凝胶中，4 ℃、100～120 V电泳6 h，取凝胶板行硝酸银染色，观察记录结果。

1.4结果判定耐药MTB菌株DNA PCR扩增产物与RFP、INH、SM、PZA、EMB敏感标准菌株和耐药质控菌株相关的DNA扩增产物比较，标本出现与耐药质控菌株相同泳动条带，则判定存在检测基因突变。

1.5统计学处理计数资料耐药株以N表示，耐药率以(%)表示，组间差异采用χ2检验。

2 结果

2.1罗氏药敏实验结果结果见表1。

与低浓度耐药株耐药率比较：*P<0.05

2.2PCR实验结果

2.2.1PCR扩增的特异性 用PCR法对68例临床MTB菌株及H37RvATCC27294敏感质控菌株进行结核DNA特异性扩增，经2%琼脂糖电泳，均扩增出相应产物，其中利福平和链霉素耐药基因PCR扩增产物结果模式见图1、2。

2.2.2PCR-SSCP分析 经解链后，RFP、INH、SM、PZA和EMB敏感株与其参考株H37Rv的单链DNA在琼脂糖凝胶电泳中迁移率相同，而耐药株中则存在不同数量的泳动变位，基因SSCP图谱与H37Rv标准株相同者判定为药物敏感株，SSCP图谱与标准株泳动有差异者，考虑存在耐药基因突变，其中利福平rpoB耐药基因和链霉素rpsL耐药基因的PCR-SSCP检测结果模式见图3、4。55例耐利福平分离株中，rpoB基因总突变率为78.2%(43/55)；43例耐异烟肼分离株中，katG基因总突变率为69.8%(30/43)；54例耐链霉素分离株中，rpsL基因总突变率为72.2%(39/54)；48例耐吡嗪酰胺分离株中，pncA基因总突变率为43.8%(21/48)，35例耐乙酰丁胺分离株中，embB基因总突变率为31.4%(11/35)。高浓度耐药基因突变率显著高于低浓度耐药株突变率(P<0.01)，具体突变率情况见表2。

图1 利福平耐药基因PCR扩增产物

M：DNA Marker；1：H37Rv ATCC27294；2：阴性对照；3～9：样本；10：阳性对照

图2 链霉素耐药基因PCR扩增产物

M：DNA Marker；1：H37Rv ATCC27294；2：阴性对照；3～9：样本；10阳性对照

图3 rpoB基因SSCP分析部分结果

1：H37Rv ATCC27294阴性对照；2：空白对照；4，6，7，8，9：突变株；3、5：敏感株；10：H37Rv ATCC35838阳性对照

表2 结核分枝杆菌耐药基因检测结果

与低浓度耐药株耐药率比较：**P<0.01

图4 rpsL基因SSCP分析部分结果

1：H37Rv ATCC27294阴性对照；2：空白对照；4～8：突变株；3、9：敏感株；10：H37Rv ATCC35820阳性对照

3 讨论

近年来，MTB耐药率不断攀升，耐药结核病已成为全球结核病防控工作面临的严峻挑战[4]。MTB基因组中很少见到通过质粒或可移动遗传元件从外界获得遗传物质的水平基因转移事件，因此耐药相关基因突变是其主要耐药分子机制[5]。MTB耐药性的出现是基因突变的一种表达方式，不同药物的耐药突变株出现的突变频率各不相同，耐药程度不同，可通过检测MTB耐药基因突变来预测表型耐药。

本研究采用PCR-SSCP方法对68例临床耐药MTB菌株进行5种耐药基因的检测，MTB对RFP产生耐药主要因其编码RNA聚合β亚单位的rpoB基因突变后，RFP与RNA聚合酶的结合能力减弱，从而导致对RFP耐药[6]。本实验55例耐RFP标本中有3例高耐株和9例低耐株未检出突变，可能是细胞壁渗透作用下降引起的，高耐株突变占总突变的63.6%，低耐株占14.6%，耐药基因检测结果提示，高浓度耐药的MTB基因突变率高于低浓度的突变率，表明MTB耐药程度与耐药基因突变之间存在着较为密切的关系。研究[7]表明katG基因的完全缺失不是INH耐药性的主要原因，katG基因突变才是引起INH耐药性的更为重要原因。实验结果中69.8%MTB耐INH分离株有katG基因突变，与戚应杰 等[8]的研究相近。其中高耐株突变率80%，更证实其与INH耐药密切相关。研究[9]显示，MTB的rpsL基因突变与SM耐药有关。本实验结果显示耐INH基因突变率72.2%，与以往报道[10]50%～85.2%相符，说明rpsl基因突变是MTB耐SM的主要原因。近年来研究[11]表明MTB耐PZA是由于PZA酶编码基因(pncA)突变，使PZA酶活性丧失或降低所致。实验的48例临床耐PZA标本中有18例高耐株发生基因突变，低耐株有3例发生基因突变，高浓度耐药菌的基因突变率高于低浓度突变率，pncA上游和pncA下游基因总突变率为43.8%，说明其基因突变范围广泛。研究[12]表明MTB耐EMB与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embABC操纵子突变或Emb蛋白表达增高有关。本实验耐EMB总突变率为31.4%，低于其他几种基因，可能是EMB基因比其他4种耐药基因更稳定，或者是该药较其他4种药物使用频率更低，具体机制尚需进一步研究。

耐药基因检测结果显示高浓度耐药的MTB耐药基因突变率高于低浓度耐药基因突变率，说明MTB耐药程度与耐药基因突变之间存在着一定的相关性，高浓度耐药的MTB与耐药基因突变相关度较高，说明rpoB、katG、rpsL、pncA、embB基因的突变是RFP、INH、SM、PZA、EMB对MTB耐药的重要分子机制。RFP总突变率最高，其次是SM，INH、PZA、EMB总突变率相对较低。本研究耐药基因检测结果与药敏结果并非完全对应，部分药敏实验耐药菌未能检出耐药基因突变，这种差别的存在说明上述耐药基因突变可能只是MTB的部分耐药机制，还存在未能检测到的耐药机制，这表明了MTB耐药机制的复杂性和多样性，提示需要做进一步研究。分子流行病学研究[13]表明，耐药MTB造成的传播事件甚至比敏感菌株更多，一个重要原因是耐药结核病患者治疗周期长或久治不愈，导致传播时间更长、传播范围更广。因此，早期、快速地检出突变菌株能为临床治疗提供有效依据，将对结核病防治起到重要作用。