甘氨酸转运体1抑制剂M22对癫痫小鼠认知障碍的改善作用研究

林力峰，梁 维，刘 洲，冼文川，钟望涛

癫痫是由于脑部神经元高度同步化异常放电而引起的慢性、反复发作的短暂性大脑兴奋-抑制功能失调综合征。其主要的临床特性是发作性、重复性、刻板性与短暂性[1-3]；有文献[4]报道30%～40%的癫痫患者均伴有不同程度的认知障碍。目前的抗癫痫药物均不能明显改善癫痫患者的认知功能损伤与多动障碍，有些药物甚至能够加重患者的认知损伤，并且加重多动障碍的发生[5-6]。

甘氨酸作为脑内最为重要的兴奋性神经递质，可激活N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)进而联合作用于谷氨酸介导的神经传递。研究[7-8]表明NMDA受体的激活，对于学习记忆能力的维持以及长时程增强起着重要的作用。研究[9-10]表明，突触间隙的甘氨酸水平又受突触前膜的甘氨酸转运体1(glycine transporter 1，GlyT1)调节，GlyT1抑制剂又可以提高NMDA受体周围甘氨酸的浓度。因此可以间接通过抑制甘氨酸转运体活性来激活NMDA受体，增强NMDA受体的活性。有研究[11]显示在癫痫模型中GlyT1抑制剂2,4-dichloro-N-{[4-(cyclopropylmethyl)-1-(ethylsulfonyl) piperidin-4-yl] methyl}benzamide (M22)具有明显的抗惊厥作用，并对于癫痫发作具有一定的治疗作用。该文主要探究GlyT1抑制剂M22对于癫痫小鼠的认知功能障碍的改善作用及其主要作用机制。

1 材料与方法

1.1试剂M22购自深圳MedChemExpress公司；甘氨酸购自上海威奥生物科技有限公司;实验所需的一抗、二抗与戊四氮(pentylenetetrazole, PTZ)均购自美国Sigma公司。

1.2动物实验动物为清洁级C57BL/6雄性小鼠50只(动物购自南京大学-南京生物医药研究院)，体质量25～30 g。动物饲养和实验场所为广东医科大学实验动物中心和广东医科大学神经病学研究所。小鼠的整体饲养在通风良好，光照周期为12 h昼夜交替，环境温度(25±1) ℃，湿度为(50±10)%的恒定环境，并可以自由饮水摄食。动物实验的所有操作在每天9:00～17:00 期间进行。所有动物实验完全符合广东医科大学实验动物中心的动物伦理学条例。

1.3癫痫模型的建立与动物分组在分组前，对实验动物进行4 d 的水迷宫训练，剔除存在学习记忆障碍的小鼠。然后将50只C57BL/6小鼠按照质量随机分为3组，分别是空白对照组(Control,n=10)，模型组(Model,n=20)，M22组(M22,n=20)。空白对照组小鼠腹腔注射等量的生理盐水，模型组和M22组小鼠则是经过腹腔注射PTZ (30 mg/kg) 制备慢性点燃癫痫模型，连续腹腔注射PTZ 2周时间，并同时通过灌胃给予M22组小鼠 40 mg/(kg·d)的M22[按照0.1%(w/v)的比例将M22均匀分散在羧甲基纤维素中]。参照癫痫发作Racine分级标准：0级：无任何反应或表现出兴奋症状；Ⅰ级：面部肌肉阵挛，包括动须、节奏性咀嚼、眨眼；Ⅱ级：伴随Ⅰ级症状，并新添加节律性点头；Ⅲ级：伴随Ⅱ级症状，并新添加肌阵挛、伴随身体直立；Ⅳ级：伴随Ⅲ级症状，并新添加后肢站立，有强直阵挛发作；Ⅴ级：伴随Ⅳ级症状，并新添加失去体位控制、跌倒。在癫痫模型点燃过程中观察其癫痫发作情况；当达到Ⅲ级并持续3 d以上时，则被认为癫痫模型已经完全点燃。

1.4认知功能检测利用水迷宫实验测试小鼠的学习记忆能力，当连续给药14 d后开始利用Morris水迷宫实验进行检测。Morris水迷宫实验水温控制在(20±0.5) ℃，加入二氧化钛使得池水变为不透明的白色，以遮盖实验小鼠在水中的嗅觉和视觉。Morris水迷宫由一个圆柱型水池(直径：80 cm；高：70 cm)和可移动站台组成(直径：8 cm)。实验时使得水面高于平台1cm。连续进行4 d训练，每天开始时，将小鼠从任意一个象限面向池壁放入水中，每次让小鼠游泳60 s来寻找隐藏的站台。如果成功地找到站台，则让小鼠在站台上停留15 s；如果60 s内未能成功找到站台，则将小鼠牵引到站台上同样停留15 s。第5天则进行测试，去掉平台并记录小鼠在60 s内在目标象限的运动总路程、目标象限停留时间等指标。

1.5海马HE染色观察行为学测试以后，立即将小鼠处死，迅速取脑组织并采用4%的多聚甲醛进行固定，常规石蜡包埋，制成厚3 μm 的切片，进行常规苏木精-伊红(HE) 染色，光学显微镜下观察海马细胞形态变化。

1.6凋亡相关蛋白测定采用Westem blot法测定Bcl-2、Bax和细胞色素C(Cytochrome C，CytC)等凋亡相关蛋白的含量表达。低温条件下取大鼠皮层脑组织，称重后液氮匀浆。4 ℃条件裂解30 min，4 ℃、12 000 r /min离心10 min，取上清液；采用BCA法测定皮层组织的蛋白含量。采用SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；冰浴条件下转膜2 h; 采用TBST 反复漂洗3 次；置于平缓摇床内，37 ℃条件下封闭孵育1 h；再用TBST 漂洗3 次加入Ⅰ抗后4 ℃孵育过夜；采用TBST 漂洗3 次后；加入荧光Ⅱ抗置于37 ℃平缓摇动孵育1 h；再一次TBST 反复漂洗3 次。然后进行凝胶图像，并对数据处理系统分析。

1.7脑皮质GFAP和FGF-2蛋白表达的测定Westem blot法检测脑组织的胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)的蛋白表达量。具体步骤如上所述。

1.8统计学处理采用SPSS 17.0软件进行统计分析，多组比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1水迷宫实验结果Model组较Control组潜伏期显著延长(P<0.05)，表明癫痫发作造成了实验小鼠的学习认知功能发生障碍；当给予M22后，M22组与Model组相比潜伏期显著降低(P<0.05)，明显恢复到Control组水平，表明M22对于癫痫导致的认知功能障碍有显著的改善作用。此外，Model组与Control组相比，穿越站台次数与目标象限活动时间都明显缩短(P<0.05)，当给予M22后M22组较Model组的穿越站台次数与目标象限活动路程均明显恢复到Control组水平。见图1。

2.2海马HE染色观察海马组织HE染色结果：Control组小鼠海马神经元细胞形态完整，边缘清晰，细胞核结构清晰并呈现圆形，染色质分布均匀；Model组小鼠海马神经元细胞则出现细胞形态模型不清，结构出现不完整，海马神经元出现不同程度的凋亡，染色质凝聚，细胞核轮廓消失；当给予M22后，小鼠海马神经元细胞则出现恢复到Control组的水平，表明M22具有神经保护作用，能够抑制神经元的凋亡，保护神经元细胞免受损伤。见图2。

2.3大脑皮层凋亡相关蛋白表达量的测定通过Western blot检测小鼠大脑皮层凋亡相关蛋白的表达量，见图3。Model组小鼠大脑皮层的Bcl-2/Bax的比值较Control组显著降低，当给予M22后，癫痫小鼠的Bcl-2/Bax的比值显著升高；此外，Model组小鼠大脑皮层的CytC蛋白表达量较Control组显著升高，当给予M22后，癫痫小鼠的CytC蛋白表达量显著降低；以上结果均表明癫痫会加速神经元凋亡，而M22具有神经保护作用。

2.4大脑皮层GFAP和FGF-2蛋白表达量的测定GFAP和FGF-2蛋白的表达见图4：Model组小鼠大脑皮层的GFAP蛋白含量较Control组显著升高；当给予M22时，小鼠大脑皮层的GFAP蛋白含量显著回调。此外，Model组小鼠大脑皮层的FGF-2蛋白含量较Control组显著降低；当给予M22时，小鼠大脑皮层的FGF-2蛋白含量显著升高。

3 讨论

癫痫是一种常见的神经系统疾病，病因复杂；但是反复的癫痫发作可导致大脑功能损伤，尤其易导致认知功能障碍。在癫痫患者中，认知功能损伤的发生率大约在30%～40%。此外，在癫痫疾病相关研究中，PTZ可诱导动物产生和人类癫痫患者相似的行为学和神经病理学改变，且PTZ并不具有神经毒性作用，因此被广泛用于抗癫痫药物研究及其相关发病机制研究[3]。

图1 水迷宫实验结果A:穿越站台次数;B：逃跑潜伏期；C：目标象限活动时间；与Control组比较：*P<0.05

图2 海马组织HE染色 ×50

图3 小鼠大脑皮层凋亡相关蛋白的测定与Control组比较：*P<0.05

图4 大脑皮质GFAP和FGF-2蛋白表达的测定与Control组比较：*P<0.05

目前，在动物学习记忆能力评价中常用的实验是Morris水迷宫实验[12]，因此本文在评价PTZ诱导的癫痫小鼠的认知功能是采用Morris水迷宫实验进行评价，结果表明PTZ导致的癫痫小鼠的潜伏期较Control组显著增加，而穿越平台次数和目标象限停留时间均显著降低，表明PTZ导致的癫痫小鼠的认知功能显著降低。当给予PTZ导致的癫痫小鼠M22后，其Morris水迷宫实验相关评价指标显著回调到Control组水平，表明M22对于PTZ导致的癫痫小鼠的认知功能障碍具有显著的改善作用。

研究[13]表明癫痫发作后，可导致海马神经元凋亡、坏死；而海马神经元与学习认知功能具有显著的相关性，海马神经元的损伤可能是其发生认知功能障碍的主要原因。因此，本文对其海马组织进行HE染色观察，结果显示Model组小鼠的海马神经元细胞出现大量坏死，当给予M22后，其神经元坏死减少，表明M22具有神经保护作用。为了进一步评价神经元的凋亡情况，对其大脑皮层的相关凋亡蛋白进行测定，结果表明Model组小鼠大脑皮层的Bcl-2/Bax的比值较Control组显著降低，而CytC蛋白表达量较Control组显著升高，当给予M22后，癫痫小鼠的Bcl-2/Bax的比值与CytC蛋白表达量均显著回调；以上结果均表明癫痫会加速神经元凋亡，而M22具有神经保护作用。

此外，星型胶质细胞对于脑部环境起着重要的控制作用，对于胞外钾离子和谷氨酸的堆积有着重要的调控作用。GFAP是星型胶质细胞激活的特异性标志物。星型胶质细胞激活表明神经细胞受到损伤，因此GFAP经常作为评价脑损伤的一个重要指标[14]。本研究测定了大鼠皮层组织的GFAP蛋白量的表达，结果显示Model组GFAP蛋白表达量较Control组显著升高，当给予M22后，其表达量显著降低，表明M22具有神经保护作用。此外，FGF-2为一种抑制细胞凋亡蛋白[15]，在Model组显著降低，当给予M22后显著回调，表明M22可抑制细胞凋亡，具有神经保护作用。

综上所述，甘氨酸转运体1抑制剂M22可以改善癫痫小鼠认知功能障碍，提高癫痫小鼠的学习、记忆能力，抑制神经元细胞凋亡，为癫痫或者难治性癫痫患者提供新的选择。