缺血预处理诱导的外泌体对心肌细胞低氧/复氧损伤及Bcl-2、Bax表达的影响

刘 中，产进中，黄 俊，张 丽，张 野，何淑芳

心肌在缺血基础上血流再灌注后损伤反而加重，称为心肌缺血再灌注损伤(ischemic reperfusion injury，IRI)。在急性心肌梗死溶栓治疗、介入治疗以及心脏外科中常常发生再灌注损伤，导致心肌损伤加重，严重影响心功能恢复。Murry et al[1]首次提出缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)的概念，证实IPC可以减轻IRI，是目前已知最强的内源性心肌保护方法，但至今具体的作用机制仍未完全明确。

外泌体是一种囊泡样小体，其中包含了丰富的蛋白质、核酸，可传输多种信号分子，是介导细胞间通讯的重要物质[2]。大量研究[3-4]显示，干细胞来源的外泌体，可作用于受损的心肌组织，抑制心肌细胞凋亡，减少梗死面积，发挥心肌保护作用。然而，外泌体是否参与介导了IPC的心肌保护作用，尚未可知。该研究拟探讨IPC诱导的外泌体对H9c2心肌细胞低氧/复氧(hypoxia/reoxygenation , H/R)损伤以及凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关x蛋白(Bcl-2 associated x protein，Bax)表达的影响，以期为IPC心肌保护机制研究提供新的思路和实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与细胞株 健康成年雄性SD大鼠，SPF级，体质量(250±30) g，由安徽医科大学动物实验中心提供，实验动物随机分为对照组(CON组)和IPC组，每组3只。大鼠H9c2(2-1)胚胎心肌细胞株购自中科院上海细胞库。

1.1.2主要试剂及仪器 无外泌体血清、ExoQuickTMExosome Precipitation Solution试剂盒购自美国SBI公司；DME/F-12细胞培养液购自美国Hyclone公司；鼠抗HSP60单克隆抗体购自美国Santa Cruz 生物技术公司；Bcl-2、Bax 单克隆兔抗购自美国CST公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞增殖检验试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)购自广州Biosharp公司；乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase，LDH)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；FITC Annexin V凋亡试剂盒购自美国BD公司；低氧小室购自加拿大Stem Cell公司；荧光显微镜购自日本Olympus公司；蛋白电泳仪、Tanon Fine Do X6全自动化学发光图像分析系统购自上海Tannon公司；Cytomics FC500 流式细胞仪购自美国Beckman有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠缺血预处理 参考文献[5]，建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。大鼠腹腔注射5%戊巴比妥50 mg/kg进行麻醉，气管插管后，连接小动物呼吸机。于左锁骨中线处切开皮肤2 cm，在第4、5肋间打开胸腔，剪开心包，轻压大鼠胸廓，挤出心脏，在肺动脉圆锥与左心耳之间冠状动脉左前降支处用6-0 Prolene线进针作一线结，回纳心脏于胸腔，稳定15 min后开始心脏缺血再灌注损伤实验，收紧线结即为结扎左冠状动脉前降支致心肌缺血，松开线结即为心肌再灌注。对心肌进行缺血5 min，再灌注5 min，3个循环，即为IPC。对照组大鼠麻醉后，仅穿线不结扎。

1.2.2血清外泌体提取 预处理结束后收集大鼠血液，采用ExoQuickTM试剂盒提取血清中的外泌体。血清以 5 686 r/min离心15 min去除细胞和细胞碎片，留取上清液；上清经过0.22 μm一次性滤器过滤，所得上清液按照试剂盒说明书，加入沉淀剂，混合均匀后，4 ℃孵育30 min；随后将孵育好的混合物在4 ℃、4 021 r/min离心30 min，离心后外泌体呈米黄色或白色沉淀沉于管底；弃上清液，再次 4 021 r/min离心5 min，留取沉淀，即为外泌体，用400 μl PBS或DMEM/F12培养液重悬，分别标记为IPC-Exo和CON-Exo，保存于-80 ℃。

1.2.3外泌体浓度测定 采用BCA蛋白定量法测定外泌体浓度，严格按照BCA试剂盒的说明书测定样品的浓度。将0.5 mg/ml的蛋白标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20 μl顺序加到96孔板的标准品孔中，各孔加入PBS补足到20 μl；上述提取的外泌体样品稀释10倍后，取5 μl加到96孔板中，加PBS补足到20 μl；各孔加BCA工作液200 μl，用加样枪轻轻吹打混匀；37 ℃孵育30 min后放入酶标仪，于波长570 nm处测定各孔的吸光度值。

1.2.4Western blot检测外泌体标志蛋白HSP60 上述提取的两组外泌体样品，取100 μl，加入RIPA裂解液冰上裂解随后与5×SDS上样缓冲液混匀，100 ℃煮10 min，制成蛋白样品。取20 μg蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜，在含5%脱脂牛奶的TBST液中室温孵育1～2 h，TBST液漂洗3次，每次10 min，加入HSP60一抗 (1 ∶500)，4 ℃孵育过夜。次日TBST液漂洗3次，每次10 min，加二抗孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，采用ECL发光试剂盒显影并采集图像。

1.2.5细胞培养 H9c2心肌细胞用含10%无外泌体血清的DMEM/F-12培养液培养，于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。选取对数生长期的细胞用于实验。当细胞密度在80%左右时，用0.25%胰酶消化1 min左右，以1 ∶3的比例传代，每隔2～3 d传代1次。

1.2.6建立心肌细胞H/R损伤模型 参照文献[6]中方法，换去H9c2细胞正常培养时的完全培养基，加入无血清无糖的低氧液(139 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、0.5 mmol/L MgCl2、1.0 mmol/L CaCl2、5 mmol/L HEPES，pH 7.4)，细胞置于低氧小室中，通入95%N2-5%CO2饱和10 min以驱除小室内的氧气，随后将低氧小室放入37 ℃培养箱中培养5 h进行低氧处理，然后用含10%无外泌体血清的完全培养基正常培养1 h进行复氧。

1.2.7实验分组及处理 H9c2心肌细胞随机分为4组：① 对照组(Control组)：H9c2细胞置于DMEM/F12细胞培养液中常规培养；② 低氧/复氧组(H/R)：将H9c2细胞进行5 h低氧和1 h复氧处理；③ H/R+IPC-Exo组：将MPC-Exo以20 mg/L的终浓度加入H9c2心肌细胞培养液，与心肌细胞共孵育12 h后，进行H/R处理；④ H/R+CON-Exo组：将CON-Exo以20 mg/L的终浓度加入H9c2心肌细胞培养液，与心肌细胞共孵育12 h后，进行H/R处理。

1.2.8心肌细胞活力的检测 将H9c2细胞接种于96孔培养板中，每孔8×103个，按上述方法进行分组及处理完成后，每孔加入10 μl CCK-8溶液(此时培养基为100 μl)，在细胞培养箱内孵育4 h后，酶标仪上于波长450 nm处测定各组吸光度值，空白对照孔为不含细胞的培养液。H9c2心肌细胞活力为实验测定孔吸光度值减去空白对照孔吸光度值。计算各组平均值。实验独立重复3次。

1.2.9检测LDH活性 接种在96孔板的H9c2细胞按照以上进行分组及处理完成后，每组各取40 μl细胞培养上清液，严格按照LDH试剂盒说明书操作，利用酶标仪于波长450 nm处测定各孔吸光度值，然后根据公式计算各组LDH活性。实验独立重复3次。

1.2.10Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡将H9c2心肌细胞以3×106个/孔接种在6孔培养板，按照上述进行分组及处理完成后，0.25%胰酶(不含EDTA)消化，PBS洗涤细胞2次，1 500 r/min离心5 min，收集细胞，用100 μl 1×缓冲液重悬细胞，每组加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，轻轻混匀后，室温避光反应15 min，每组再加入400 μl缓冲液重悬细胞，随后流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。以单染PI细胞和单染Annexin-V-FITC细胞作为基准参照，每个样本获取3×104个细胞，用FCS Express V 4.0软件进行分析。实验独立重复3次。

1.2.11Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白表达 按照上述分组及处理结束后，提取各组细胞内总蛋白，制备蛋白样品。取20 μg蛋白样品经电泳后，转膜，后在含5%脱脂牛奶的TBST封闭液中室温孵育1～2 h，TBST液漂洗3次，每次10 min，加入Bcl-2、Bax一抗 (1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日TBST液漂洗3次，每次10 min，加入二抗孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，采用ECL发光试剂盒显影并采集图像。采用Image J软件进行分析，以Bcl-2或Bax与β-actin条带灰度值之比来表示蛋白相对表达量。

2 结果

2.1IPC对外泌体释放的影响采用BCA蛋白定量法测定血清外泌体浓度，结果表明CON-Exo浓度为(7.46± 1.77)mg/ml，IPC-Exo浓度为(14.93±1.27)mg/ml，提示IPC可诱导血清外泌体释放显著增加(P<0.01)，见图1A。Western blot 结果显示IPC-Exo、CON-Exo均表达外泌体标志性蛋白HSP60，见图1B，且IPC后提取的外泌体中HSP60蛋白表达水平增加(P<0.05)。

图1 IPC对外泌体释放的影响

A:两组外泌体浓度统计分析图；B: Western blot检测血清外泌体标志蛋白HSP60，且IPC后提取的外泌体中HSP60蛋白表达水平增加；与CON-Exo组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.2IPC-Exo对H9c2心肌细胞活力的影响H9c2细胞活力检测结果如图2所示，与CON组(1.14± 0.09)相比，H/R组(0.47±0.08)细胞活力明显降低(P<0.01)；与H/R组比较，H/R+IPC-Exo组(0.78±0.04)细胞活力增加(F=169.1，P<0.01)；而H/R+CON-Exo组(0.51± 0.11)细胞活力无明显增加，差异无统计学意义，说明IPC-Exo可以明显增加细胞活力。

2.3IPC-Exo对H9c2心肌细胞LDH的活性的影响细胞培养液中LDH的水平可以用来表示细胞损伤的程度，各组测得结果分别为CON组(67.33±9.71)、H/R组(166.00 ±12.17)、H/R+IPC-Exo组(111.33± 11.68)、H/R+CON-Exo组(149.67± 13.80)。如图3所示，与CON组比较，H/R组心肌细胞H/R损伤后LDH活性明显增加(P<0.01)；与H/R组比较，H/R+IPC-Exo组可减轻心肌细胞H/R损伤，降低H9c2心肌细胞LDH的活性(F=40.73，P<0.05)。而H/R+CON-Exo组LDH活性无明显变化，差异无统计学意义。提示IPC-Exo能够降低H9c2心肌细胞LDH的活性。

图2 IPC-Exo对H9c2心肌细胞活力的影响

1：CON组；2：H/R组；3：H/R+IPC-Exo组；4：H/R+CON-Exo组；与CON组比较：##P<0.01；与H/R组比较：**P<0.01

图3 IPC-Exo对H9c2心肌细胞LDH的活性的影响

1：CON组；2：H/R组；3：H/R+IPC-Exo组；4：H/R+CON-Exo组；与CON组比较：##P<0.01；与H/R组比较：*P<0.05

2.4IPC-Exo对H9c2心肌细胞凋亡的影响Annexin-V-FITC/PI双染法检测心肌细胞凋亡，结果表明，与CON组比较，H/R组凋亡细胞(右上象限、右下象限)明显增多(P<0.01)；与H/R组比较，H/R+IPC-Exo组凋亡细胞明显减少(F=13.63，P<0.05)；而H/R+CON-Exo组心肌细胞凋亡率无明显变化，差异无统计学意义，见图4，表明IPC-Exo可以抑制H9c2心肌细胞凋亡。

2.5IPC-Exo对H9c2心肌细胞Bcl-2、Bax表达的影响Western blot检测结果表明，与CON组比较，H/R组心肌细胞H/R损伤后Bcl-2表达明显减少(F=5.736，P<0.05)，Bax表达增加(F=26.02，P<0.01)，而H/R+IPC-Exo组Bcl-2表达增加、Bax表达减少，与H/R组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而H/R+CON-Exo组差异无统计学意义，见图5，说明IPC-Exo能上调H9c2细胞Bcl-2表达、下调Bax表达。

图4 IPC-Exo对H9c2心肌细胞凋亡的影响

1：CON组；2：H/R组；3：H/R+IPC-Exo组；4：H/R+CON-Exo组；与CON组比较：##P<0.01；与H/R组比较：*P<0.05

3 讨论

近年来，外泌体在心血管疾病中的作用得到广泛关注，外泌体在缺血性心脏病中的重要作用逐渐得到认识。研究[4]显示，间充质干细胞来源的外泌体能明显减小小鼠的心肌梗死面积，通过增加ATP水平，减少氧化应激，激活PI3K/Akt 通路，从而减轻IRI。同时有研究[7]表明，血浆外泌体可以介导蛋白HSP70的转运，激活心肌细胞内ERK和p38 MAPK信号通路从而减轻I/R损伤，从而起到心肌保护作用。此外，心脏祖细胞来源的外泌体在小鼠心肌梗死中也发挥作用，可抑制心肌细胞凋亡，减少心肌梗死面积，改善心脏功能[8]。以上研究均表明，外泌体在缺血性心脏病中具有心肌保护作用，这为IRI后心肌修复治疗提供了新策略和新思路。

IPC是指反复几次短暂缺血再灌注后，可诱导心脏产生内源性保护机制，使其对后面较长时间的缺血性损伤产生明显的耐受，显著减少心律失常的发生以及减轻梗死面积。然而IPC减轻IRI的确切机制仍未完全阐明。研究[9]表明主要是涉及细胞因子、凋亡基因、激活激酶途径等。进一步深入研究IPC的作用机制，将促进其在心肌梗死、心脏再灌注等临床治疗中的应用，为预防或减轻IRI提供新靶点。本研究通过在大鼠体内进行IPC，预处理结束后收集血液，随后分别提取CON组和IPC组血清中的外泌体，采用BCA蛋白定量法测定血清中外泌体浓度，结果表明IPC组外泌体浓度明显高于CON组，表明IPC可刺激内源性外泌体的释放，从而增加其在血清内的含量。外泌体含量及内容物的变化，可以反映机体的生理病理状态，对机体产生不同的影响[10]。Giricz et al[11]研究发现，离体灌流的供体心脏经过IPC处理后，其冠脉流出液中的细胞外囊泡(其中包含外泌体)，可以减轻受体心脏的IRI损伤。此外有研究[12]显示，缺血预处理可以刺激富含miRNA-144的外泌体的释放，而miRNA-144激活PI3K/Akt和ERK信号通路，从而发挥心肌保护作用。

图5 IPC-Exo对H9c2心肌细胞Bcl-2、Bax表达的影响

A：Bcl-2；B：Bax；1：CON组；2：H/R组；3：H/R+IPC-Exo组；4：H/R+CON-Exo组；与CON组比较：#P<0.05，##P<0.01；与H/R组比较：*P<0.05

为进一步探讨IPC诱导释放的血清外泌体对H/R损伤的影响，将IPC-Exo与H9c2心肌细胞共孵育12 h，随后进行H/R损伤，研究结果表明，IPC-Exo能增加H9c2心肌细胞活力，降低LDH的活性，抑制心肌细胞凋亡，而CON-Exo并未有此作用。心肌细胞凋亡是IRI中重要的损伤环节，在其发生中扮演着重要角色。研究[13]表明，细胞凋亡是一种受多基因控制的程序性死亡，并且Bcl-2和Bax是细胞凋亡的重要调控因子。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，主要通过抑制细胞色素c的释放来调节凋亡[14]。相反，Bax是促细胞凋亡基因，可抑制Bcl-2活性或作用于线粒体膜通透性转换孔导致线粒体通透性改变，引起一系列级联反应[15]。本研究结果表明，H/R组心肌细胞H/R损伤后细胞凋亡率明显增加，而H/R+IPC-Exo组凋亡细胞明显减少，同时显示H/R组Bcl-2表达明显减少，Bax表达增加，而H/R+IPC-Exo组Bcl-2表达增加、Bax表达减少，表明IPC-Exo能上调Bcl-2蛋白、下调Bax蛋白的表达。据此，推测IPC-Exo可以减轻H9c2心肌细胞H/R损伤，其机制可能是通过上调Bcl-2、下调Bax表达抑制心肌细胞凋亡从而发挥心肌保护作用。然而，本研究主要在H9c2细胞上进行的，H9c2细胞是大鼠胚胎心肌细胞株，但其不同于原代的乳鼠心肌细胞和成年心肌细胞，因此IPC诱导释放的血清外泌体是否能够减轻原代心肌细胞H/R损伤，发挥心肌保护作用，有待于进一步研究。此外本研究只观察了Bcl-2和Bax的变化，探讨了初步的分子机制，具体的作用机制有待于进一步研究。