配子体型自交不亲和调控机制的研究进展*

李富婷， 唐飞， 高冬丽， 段思凡， 李云海， 李灿辉， 马玲

(云南师范大学 生命科学学院,马铃薯科学研究院，云南 昆明 650500)

自然界中，40%的开花植物中存在自交不亲和(self-incompatibility,SI)现象，涵盖了至少100种植物种类[1].对多数雌雄同株的植物而言，同一朵花中的雌雄蕊相互靠近，因此自身花粉容易落在自身的柱头上.如果没有自交不亲和的生殖隔离，易造成自体受精，不利于基因间的重组，造成物种基因型单一，影响植物应对复杂的生存环境，因此一直以来自交亲和连同自交衰退被普遍认为是造成物种灭绝的重要原因[2-3].因此对物种而言，存在着维持自交不亲和的进化压力，这也是显花植物普遍自交不亲和的原因[4].

多数具有自交不亲和现象的物种中，其自交不亲和过程受到高多态性S位点的调控[5-6].研究发现S位点内的基因是以一个整体的形式向后代传递.S位点内的基因之间几乎不发生重组，作为一个遗传单元，完全符合孟德尔遗传规律，因此S位点又被称为S单倍型(S haplotype).S位点内至少包含了分别决定雌雄配子特异性的S因子，而雌雄配子S因子之间的分子识别作用是植物对自我和异我花粉进行区分的物质基础[7-8].

在被子植物漫长的进化过程中，出现了两种截然不同的分子机制调控自交不亲和过程[9].按照调控机制的不同，植物的自交不亲和可以分为配子体型自交不亲和和孢子体型自交不亲和.配子体型自交不亲和是指仅由雌雄配子的S因子类型决定了是否亲和，而雌雄配子均是植物的配子体世代，因此称之为配子体型自交不亲和，典型代表是茄科、蔷薇科和罂粟科；而孢子体型自交不亲和是由花柱和花粉的S因子的类型共同决定的，其中花柱的S因子的类型起决定作用，而花柱是植物孢子体世代的器官，因此被称为孢子体型自交不亲和，典型代表是十字花科[5].配子体自交不亲和是植物界分布最广泛的自交不亲和调控机制[10].下面将主要阐述以马铃薯所属的茄科为代表的配子体型自交不亲和的调控机制.

1 雌配子中的S因子

雌配子中决定自交不亲和的S因子应具有以下几个特征：首先在花柱中高表达，其次具有高多态性，以区分不同类型的S单倍型[9].Bredemeijer等对烟草的花柱特异性蛋白进行研究时发现，不同S基因型植株的花柱特异性蛋白的等电点和分子量均不相同，说明花柱中雌配子S因子确实具有很高的多态性[11].Anderson等从烟草中首次克隆出了花柱特异性蛋白的全长cDNA，继而又证明其具有核酸酶活性，因此被命名为S-RNase[8,12-14].McClure等证实，授粉后自花花粉管中的rRNA被大量降解，异花花粉管中的rRNA不受影响，这表明自交时，S-RNase可能通过其核酸酶活性大量降解自花花粉管中的rRNA，从而终止花粉管的延伸[15].Huang等通过转基因实验证实了S-RNase的核酸酶活性对于自交不亲和反应是必须的[7].2012年，Juan等发现授粉2到8天内，亲和及不亲和的花粉管中肌动蛋白丝的形态存在明显区别：在不亲和的花粉管中，肌动蛋白丝的聚合度由60%下降至20%，而自交亲和的花粉管中，肌动蛋白丝的聚合度始终维持在70%左右.说明在自交不亲和的花粉管中，除了rRNA被大量降解外，肌动蛋白丝也发生了解聚，导致细胞骨架发生改变[16].2018年，在蔷薇科苹果中，发现S-RNase可直接抑制MdMVG的活性，后者参与调控花粉管细胞中的微丝平衡，最终造成花粉管细胞中微丝聚合与解聚的失衡，导致花粉管细胞骨架异常[17]；同年在中国梨中发现,S-RNase可直接与肌动蛋白丝结合，促进肌动蛋白丝解聚，最终造成花粉管细胞发生程序性死亡，并且S-RNase促进肌动蛋白丝解聚的能力不依赖于其核酸酶活性[18].

以上研究结果表明，S-RNase既能大量降解花粉管中的rRNA，也可以直接或间接导致肌动蛋白丝大量解聚造成花粉管的细胞骨架发生解体.无论是降解rRNA还是解聚肌动蛋白丝，均会对花粉管细胞造成不可逆的损害，终止花粉管延伸，最终导致花粉管细胞发生程序性死亡，因此对花粉管细胞而言，S-RNase具有细胞毒性，是一种“毒蛋白”.

迄今为止，已经从茄科、蔷薇科和玄参科等多种配子体型自交不亲和植物中分离出近百个S-RNase基因[10].对其蛋白产物进行序列比对后发现，S-RNase是一种碱性糖蛋白，其N末端有一段22～27个氨基酸残基的信号肽区域，介导了S-RNase在花柱细胞中合成后向细胞外基质分泌的过程.不同单倍型的S-RNase的糖基化修饰程度并不相同，去除糖基化修饰不会影响S-RNase的核酸酶活性，也不影响S-RNase诱导产生的自交不亲和反应.S-RNase的糖基化修饰水平可能会影响产生自交不亲和反应时所需的S-RNase的最低量即自交不亲和反应中S-RNase的阈值水平[19].除糖基化修饰位点及信号肽区域外，茄科植物的S-RNase具有五个保守结构域(Conserved region,C1-C5)和两个高变结构域(Hypervariable region,HVa和HVb)[20]，其中C1、C4和C5是疏水的，组成了S-RNase的内核区域，C2和C3是核酸酶活性区域，其中C3结构域上116位的His残基对于维持核酸酶活性是必须的，突变His116可以导致S-RNase核酸酶活性丧失[21-22].两个高变区域HVa和HVb位于C2和C3之间，组成高变结构域的氨基酸残基基本上属于极性氨基端，是可溶性基团，暴露在蛋白表面，可能是S-RNase的特异性决定部位，参与了S-RNase与其他蛋白的相互识别过程[20,23].

虽然目前对雌配子S-RNase的作用机制有比较深入的研究，但是S-RNase蛋白进入花粉管细胞的方式并不清楚.2000年，Luu等通过免疫金标记S-RNase的方法证实各种单倍型的S-RNase均能够进入花粉管细胞中，没有基因型特异性[24]；2006年Goldraij等采用三重标记法即用胼胝体抗体标记花粉管细胞的膜系统，用S-RNase的抗体标记各种基因型的S-RNase，同时用120KDa的抗体标记120KDa蛋白，对亲和与不亲和的花粉管分别进行观察，发现亲和型和非亲和型花粉管均能从花柱传导组织中吸收S-RNase蛋白，进入花粉管中的S-RNase蛋白被限制在特殊的区域中，120KDa蛋白标记着S-RNase蛋白存在区域的界限[25].2014年，Meng等发现花粉管吸收S-RNase需要高尔基体囊泡参与，微管蛋白调节了这一过程，证实了S-RNase是通过胞吞作用进入花粉管细胞的[26]，但胞吞作用的具体环节(包括鉴定膜上负责识别S-RNase的蛋白分子)还需要深入研究.

通过对雌配子S因子的研究进展总结得出雌配子S因子参与调控自交不亲和的过程：雌配子S因子编码一类糖蛋白，在花柱表皮细胞中合成后，分泌到花柱的传导组织中，花柱传导组织是花粉管延伸至胚珠的通道.配子体型自交不亲和植物的柱头属于湿式柱头，正常育性的花粉落在柱头上，一般均能吸水萌发，萌发出的花粉管延伸到花柱传导组织中时，传导组织中的S-RNase通过胞吞作用进入花粉管细胞中，S-RNase发挥其细胞毒性，大量降解自花花粉管细胞中的rRNA，并通过直接或者间接的方式促进肌动蛋白丝发生解聚，改变花粉管的细胞骨架，诱导花粉管细胞发生程序性死亡，终止花粉管的延伸.

无论是亲和型或是不亲和型的花粉管，均能吸收S-RNase蛋白，没有S基因型特异性，而亲和型的花粉管细胞可以正常延伸至胚珠，完成双受精作用，说明亲和型花粉管存在解除S-RNase细胞毒性作用的“解毒机制”.事实上，在漫长的进化过程中，植物进化出各种类型的 “解毒机制”，用于实现对花粉管继续萌发与否的调控，其中最重要的就是由雄配子S因子介导的对S-RNase的“解毒机制”.

2 雄配子中的S因子

如果说雌配子中的S因子编码的是一类细胞“毒性蛋白”，那么雄配子中的S因子编码的就是一类针对雌配子S因子的“解毒蛋白”.

在寻找花粉S因子的过程中，最早认为作为花粉S因子的基因应该具有以下特征：首先花粉S因子应该在花粉中高表达；其次，花粉S因子应该与S-RNase基因紧密连锁，共同组成S位点；花粉S因子的基因序列存在与S-RNase基因的多态性相对应的高度变异水平，以介导对不同S-RNase基因的识别作用.Lai等通过对S基因座进行长片段测序，首次在金鱼草中发现了一个编码F-box蛋白的基因AhSLF-S2，该基因与S2-RNase紧密连锁，在花粉中特异表达[27].Entanit等和Ushijima等人也分别从蔷薇科果梅和扁桃的S位点中鉴定出多个编码F-box蛋白的基因[28-29].在寻找花粉S因子的过程中，早期研究者认为花粉S因子应该类似于雌蕊S因子是一个具有高度多态性的基因，虽然在对含有S位点的长染色体片段进行测序时多次发现了F-box基因，但由于单一F-box基因的多态性显著低于S-RNase基因的多态性，因此一直怀疑F-box基因是否是花粉S因子.直到借助于转基因的方法在矮牵牛和金鱼草中分别证明了F-box基因决定了花粉自交不亲和特异性反应，才首次确认了S基因座里的F-box基因就是花粉S因子，并将之命名为S-locus F-box基因，缩写为SLF/SFB基因[30-31].在后续的研究中发现蔷薇科植物中的花粉S因子的作用方式存在分离，因此为了相互区分，一般将李属植物中的花粉S因子命名为S haplotype-specific F-box (SFB)基因，而在苹果属植物中被命名为S-locus F-box brothers(SFBB)基因，但也存在例外，整体而言蔷薇科中的花粉S因子缺乏统一命名规则[6,32].

目前关于花粉S因子的研究以矮牵牛中研究的最为详细，矮牵牛也成为研究花粉S基因功能使用最为广泛的植物.由于不同物种中花粉S基因命名规则及作用方式存在较大不同，因此下文将主要总结矮牵牛中花粉S因子的研究进展.

在Sijacic等确定了SLF基因是花粉S因子以后，研究表明F-box蛋白一般是作为E3泛素连接酶的亚基起作用，因此早期建立了蛋白降解模型用于解释花粉S因子对S-RNase的作用.该模型认为SLF蛋白作为E3泛素连接酶中的底物识别亚基，连同E1泛素活化酶和E2泛素连接酶一起，介导了对S-RNase的泛素化作用，被泛素化修饰的S-RNase经由26S蛋白酶体降解，从而解除了S-RNase的细胞毒性作用[33-35].按照蛋白降解模型，所有异我型的S-RNase都会被SLF蛋白通过泛素途径降解，但后来发现S3-SLF不能降解S2-RNase，而S7-SLF不能降解S5、S11和S19型S-RNase[36]，这一发现引导研究者们将注意力转向S位点内其他的F-box基因，并最终建立了协同性非自我识别模型用于解释花粉S因子对S-RNase的解毒过程.该模型认为：首先，花粉S因子不是某一个特定的F-box基因，而是由S位点内多个F-box基因共同决定了花粉的自交不亲和特性；其次，单一的SLF基因只能识别一种或一类S-RNase，介导其被26S蛋白酶体降解；再次，S位点内的多个F-box基因共同作用，介导了对所有异我型S-RNase的降解；最后，没有一种F-box基因可以降解自我型的S-RNase，因此矮牵牛自花授粉是不亲和的，而杂交授粉是亲和的[36-37].按照这个模型，花粉S因子指的是S位点中多个F-box基因的组合，这也解释了为什么单一的F-box基因的多态性显著低于S-RNase基因的多态性，而多种F-box基因的多态性显著高于S-RNase基因的多态性，充分保证各种类型的异我型S-RNase均可被识别并降解.

在确定了花粉S因子是F-box基因的组合后，后续研究集中在对F-box基因的克隆和作用方式的研究上.在对F-box蛋白作用方式的研究中，Hua等在矮牵牛中首次鉴定了PiCUL1-G，PiSBP1，PiSBP1与F-box蛋白互作组成了SCF(Skp1/Cullin/F-box)复合体，该复合体可直接与各类S-RNase蛋白结合[33].Entani等证明了SCF复合体可以对各种类型的S-RNase蛋白进行泛素化修饰，且被泛素化修饰的S-RNase蛋白经由26S蛋白酶体降解[34]，这说明尽管多个F-box基因共同组成了花粉S因子，通过协同性非自我识别系统对各类异我型S-RNase进行识别，但单一的F-box基因仍然是通过蛋白降解模型发挥作用的，且各类F-box蛋白组成的SCF复合体中，除F-box蛋白以外的其他亚基均是相同的[38].

Williams等通过转录组测序在S2和S3单倍型的矮牵牛的S位点中，均鉴定出17个SLF基因[39]，其中8个SLF基因被证明参与了对各类S-RNase的识别过程[30,40-41]，其他SLF蛋白的功能还需要进一步验证.目前在矮牵牛中鉴定出17个SLF基因，发现这些SLF基因均位于S-RNase基因物理序列的下游，具有相同的转录方向，且均与S-RNase基因的转录方向相反，目前还不清楚是否所有物种的S位点内基因均具有这种特殊的排列及转录方向.

对花粉S因子及其作用方式进行总结如下：花粉S因子编码的是F-box蛋白，与Skp1和Cullin共同组成了SCF复合体，SCF复合体行使E3泛素连接酶的作用，实现对进入花粉管细胞中的S-RNase的识别和泛素化修饰作用，被泛素化修饰的S-RNase最终被26S蛋白酶体降解从而解除了S-RNase的细胞毒性，花粉管可以继续延伸，完成受精作用，一种F-box蛋白介导了对一个或一类S-RNase蛋白的识别作用，多种F-box蛋白协同作用识别并降解所有异我型S-RNase，但没有一种类型的SLF蛋白可以介导对自我型S-RNase的识别和泛素化作用，因此自交不亲和而杂交是亲和的.

在花粉管细胞内，SCF复合体对S-RNase的泛素化修饰程度并不是确定水平的，存在单泛素化修饰和多泛素化修饰.被单泛素化修饰的S-RNase可能并不会被26S蛋白酶体降解，而是被细胞内膜系统分拣至液泡中存储起来，而被多泛素化修饰的S-RNase才会直接被26S蛋白酶体降解，这可能是造成有的实验室观察到S-RNase在花粉管细胞内是被隔离在细胞膜系统内[25]，而有的实验室则观察到亲和的花粉管内的S-RNase是大量被降解的.可能S-RNase进入花粉管后，在不同的时间或者泛素化程度不同，造成S-RNase的处理结果并不相同，这只是一种推测，还需要进一步的实验证明，这也说明了对配子体自交不亲和过程的认识还很模糊，需要进一步深入研究.

3 研究展望

目前对以S-RNase的细胞毒性作用为基础的配子体型自交不亲和的分子调控机制取得了重大进展，基本已确定了雌雄蕊S因子的基因编码产物，并已确立了以协同性非自我识别模型为基础的雌雄蕊S因子间的相互作用模式，但是还有很多未知的领域需要进一步研究.对配子体型自交不亲和调控机制需要深入研究的领域主要有以下几点：

(1)蔷薇科、茄科和车前草科的自交不亲和均是以S-RNase的细胞毒性作用为基础的，被认为具有相同的S-RNase基因起源[42-43]，而茄科的SLF基因被认为与蔷薇科的SFBB基因具有相同的起源[41]，但是缺乏对配子体型自交不亲和基因的宏进化分析，特别是各类S单倍型的进化动力研究；

(2)各种SLF蛋白与S-RNase蛋白之间的识别作用是否有普遍规律？目前只鉴定了少数几种SLF蛋白对各种类型S-RNase的识别作用，并不能回答为何特定类型的SLF蛋白只能识别一种至多几种S-RNase以及为何所有的SLF蛋白均不能识别自我型S-RNase；

(3)SLF蛋白组成的SCF复合体对S-RNase的泛素化修饰程度及被泛素化修饰的S-RNase蛋白的命运还需要进一步实验证明，这决定了花粉S因子到底是以何种方式实现对S-RNase蛋白的解毒作用的；

(4)虽然已经明确S-RNase蛋白是通过胞吞作用进入花粉管的，但对这一过程的具体调控机制几乎一无所知.

总体而言，自20世纪80年代鉴定出雌蕊S因子以后，对配子体型自交不亲和的分子调控机制的研究一直是植物分子生物学的热点问题之一，新的实验技术及已取得的进展将为全面解析配子体自交不亲和的调控过程提供有力支撑.