马铃薯叶片发育畸形基因的遗传分析*

张黎冬， 杨中敏， 唐蝶， 杨典， 李晓凤， 祝光涛

(云南师范大学 生命科学学院,马铃薯科学研究院，云南省马铃薯生物学重点实验室，云南省高校马铃薯生物学重点实验室，云南 昆明650500)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)为茄科茄属双子叶一年生植物，适应性强，分布范围广，是仅次于小麦和水稻的世界第三大粮食作物，同时它也是全球最重要的块茎类作物[1].马铃薯营养丰富，含有大量的微量元素、蛋白质、氨基酸、B族和C族维生素，具有人类“第二面包”的美誉[2].

光合作用将太阳能转化为可供绿色植物代谢的碳能，光合产物代谢产生ATP提供其他代谢或者运输所需的动能[3-4].叶片是最重要的光合作用场所，叶片发育体现了植物发育内外部的动态变化过程[5].叶片(源)产生光合产物供给植物其他组织(库)的能力是作物产量的主要决定因素[6].此外，马铃薯一些与结薯相关的信号分子也在叶中合成，通过茎传递到匍匐茎促进马铃薯块茎的形成[3,7].

在马铃薯中，叶的光合能力受发育和环境控制[1].因而鉴定叶片发育的基因，对于解析叶片的发育过程以及合理调控植物的光合能力和产物具有重要的意义.研究以二倍体马铃薯为研究材料，构建了一个与叶片发育相关的分离群体，相较于正常植株，突变植株呈现叶片发育畸形，硬化变厚，微黄，叶绿素积累不足等表型，同时整个植株明显变小.研究结合混合群体分离分析(Bulked Segregant Analysis-seq，BSA-seq)以及indel分子标记的筛选，将控制叶片发育畸形的基因缩小至400 kb的区间，同时结合基因组信息以及注释信息筛选出一个候选基因.

1 材料与方法

1.1 实验材料

CIP 701165(P1)为母本与课题组创制的亲和材料E-172(P2)为父本进行杂交获得F1群体，从F1中挑选单株与P1回交获得BC1群体，BC1进行自交创制了BC1S1分离群体.BC1S1群体出现了正常叶片以及畸形叶片的分离，该群体则用于后期畸形叶片的遗传分析和基因定位.

1.2 实验方法

1.2.1 表型鉴定和混合群体分离分析

播种的二倍体马铃薯种子出苗后一个月便可观察叶片的表型.从后代中挑选叶片正常和畸形的单株各20株，参考刘秀丽等的CTAB法分别提取叶片基因组[8]，晾干后加入含RNase酶的蒸馏水溶解核酸.测定每一份DNA的浓度，将正常叶片与畸形叶片的样品分别吸取等量的DNA混合，送至北京诺和公司测序.数据测量完毕后，首先区分基因组的两套单倍型.建立单倍型具体方法：将提取的亲本BC1和BC1S1群体提取的DNA深度测序，深度为20×.将亲本重测序reads比对到DM参考基因组上，提取杂合SNP位点构成杂合SNP集，再将后代重测序的reads比对到参考基因组,并提取后代每个单株在亲本杂合SNP位置的基因型，得到自交后代纯合的区域，利用个体间纯合区域进行延伸，获得亲本的两套单倍型.

其次，以亲本中的任一的一套单倍型作为参考序列，分别计算两个极端池的基因型频率并计算SNP-index及其差值Δ(SNP-index)，利用R语言对SNP-index和Δ(SNP-index)画图[9].具体操作为：使用bwa软件将每个个体比对到DM参考基因组上，然后使用samtools比对得到的bam文件排序去重并提取变异位点，使用1 Mb为计算单位,100 kb为滑动窗口分别计算两池的SNP-index，并计算两者的差值Δ(SNP-index).利用R语言对SNP-index和Δ(SNP-index)画图，横坐标代表滑动窗口在染色体上的物理位置，纵坐标代表SNP对应的SNP-index和Δ(SNP-index).取全基因组Δ(SNP-index)的最高1%的窗口中的最小限值作为阈值.

1.2.2 DNA 提取以及精细定位

根据实验室提取DNA的操作流程，使用八连排和U型板批量提取基因组.具体操作如下：将叶片放入八连排管中.加入钢珠以及250 μL CTAB溶液，利用细胞破碎仪震荡破碎组织.65 ℃水浴1 h后冰浴.待样品温度凉至室温，于通风橱中加入等体积的氯仿抽提.4 000 rpm离心10 min，吸取140 μL上清转移到0.4 mL U型板中并加入等体积的异丙醇，将样品板置于 -20 ℃ 冰箱沉淀1 h.4 000 rpm离心10 min，弃上清加入200 μL 75%乙醇洗涤，室温晾干，加入100 μL含RNase酶的蒸馏水，放入37 ℃培养箱1 h，溶解核酸并消化RNA.

结合混合群体分离分析结果，在初定位区间设计引物并进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选重组单株以进行候选基因的精细定位.分子标记引物序列如表1，PCR体系为11 μL，5.5 μL Promega Mix混合液，4.1 μL H2O，正反向引物各0.2 μL，1 μL模板，PCR程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35个循环；72 ℃ 7 min，16 ℃保存.聚丙烯酰胺凝胶电泳胶浓度为8%，根据PCR产物片段大小，跑胶时间为60～90 min.利用银染法显色，分析结果并统计重组单株.

1.3 数据分析

对于每一对引物所扩增出的PCR产物，以已知表型作为对照，将叶片发育畸形的记录为“a”，与之对应的等位基因记录为“b”，杂合状态记录为“h”.

根据定位区间，结合马铃薯参考基因组DM的注释信息，预测叶片发育畸形基因，并分析相关基因的表达量.

2 结果与分析

2018年春于云南英茂花卉公司实验基地播种了F1分离群体2 000株.通过表型调查，1 489株植株叶片表型正常，511株植株叶片发育畸形(图1A，图1B).正常与畸形植株叶片的分离比为3∶1(χ2=0.318，P=0.57)，分离比符合孟德尔单基因控制性状的分离比，表明此分离群体中叶片畸形的基因是由隐性单基因控制.

通过对马铃薯叶片发育正常池以及叶片发育畸形池进行测序，与马铃薯参考基因组DM比对找出SNPs，并计算所有SNP的SNP-index.根据叶片发育正常池以及叶片发育畸形池的SNP-index，计算两个池的绝对差值Δ(SNP-index).以马铃薯染色体为横坐标，差值为纵坐标作图(图1C)，在2号染色体末端出现了两个明显的峰值.根据此区间的SNP不平衡情况以及该性状由单基因控制，选择差值信号位点最大的位置进行后续的研究.选取Δ(SNP-index)> 0.5，将控制二倍体马铃薯叶片发育畸形的基因初步定位于36.06 Mb～48.24 Mb.

(A)左植株发育正常，右植株发育畸形.(B)叶片表型.正常植株正常生长，植株中部叶片呈绿色，叶片形状为仄形；畸形植株生长速度降低，植株中部叶片泛黄，叶片形状不规则，叶片硬化.(C)BSA-seq结果

图1叶片表型及叶片突变体基因的初定位

Fig.1The phenotype and primary mapping of the abnormal leaf mutant

为了进一步获得控制马铃薯叶片发育畸形的基因，利用indel-分子标记的方法筛选初步定位区间的交换单株，以此缩短候选基因所在的区间.将叶片发育正常以及畸形池与亲本比对，筛选出13对具有多态性的indel标记 (表1).

表1 精细定位所用的分子标记

图2叶片发育基因主效位点的精细定位

Fig.2The fine mapping of major effects gene which regulates leaf development

经过混合群体分离分析以及遗传连锁分析，将叶片发育畸形的基因缩小范围至2号染色体37.630 Mb-38.031 Mb之间,间隔400 kb.结合马铃薯参考基因组的注释信息，此区间存在36个基因(图2)，其中在已公布的二倍体马铃薯品种DM和RH叶片中均表达的基因有16个(表2).

表2 候选基因表达量分析

在16个候选基因中，核糖体蛋白S15(PGSC0003DMG400007336)是核糖体组装蛋白[10]；泛素蛋白连接酶(PGSC0003DMG401013630)修饰泛素蛋白，泛素蛋白和植物蛋白的半衰期及定位相关[11]；铜是植物生理活动必不可少的金属元素[12]，在拟南芥的研究中表明铜转运体(PGSC0003DMG400013653)作用于根的生长和花粉的发育[13]；Ctp 合酶(PGSC0003DMG400013634)催化CTP的合成[14]；C端锌指结构(PGSC0003DMG400013662)与甲基化修饰[15]和诱导细胞分化[16]相关；环指蛋白113A(PGSC0003DMG400013655)[17]和腺嘌呤糖基化酶(PGSC0003DMG400013631)[18]作用于DNA损伤修复；微染色体维持蛋白(PGSC0003DMG400013633)在真核生物DNA复制起始和延伸阶段具有重要作用[19]；转运蛋白Sec24(PGSC0003DMG401013636，PGSC0003DMG402013636)和其他转运蛋白结合形成蛋白复合物参与细胞内代谢物的运输[20]；钙调素结合蛋白(PGSC0003DMG400013656)发现于平滑肌中[21]；谷氧还蛋白(PGSC0003DMG400013635)[22]和硫氧还蛋白还原酶(PGSC0003DMG400013638)[23]调节细胞氧化还原状态；3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(PGSC0003DMG400013663)[24]可能通过氧化还原作用提高生物量的合成；丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PGSC0003DMG400013661)种类多样，作用于细胞调控的各个方面[25].

研究中异常植株叶片发育畸形，颜色泛黄，可能和植物叶绿体发育相关.排除以上15个候选基因，将三半乳糖基二酰甘油2蛋白基因(PGSC0003DMG400007324，ProteinTRIGALACTOSYLDIACYLGLYCEROL2，TGD2)作为最终候选基因，该基因影响植物质体发育[26].根据参考基因组及转录组数据，该基因在叶片中表达且表达量高于其他组织.

3 讨 论

利用图位克隆的方法筛选出一个控制马铃薯叶片发育的候选基因.从马铃薯表型观察，畸形植株的叶片发育状态不佳，叶片发黄，形状不规则，硬质化严重.叶绿体是植株进行光合作用的重要场所.叶绿体的数量和形态直接影响叶片的颜色.因此，与叶片叶绿体生物合成和发育相关的基因表达发生改变则会导致叶片失去绿色[1,27-28].

利用现有的群体数量，将控制马铃薯叶片发育的基因缩至范围为400 kb的区间.结合参考基因组信息，此区间内含有36个基因，包含12个未知功能基因.该区间有一个与质体发育相关的基因三半乳糖基二酰甘油2 蛋白 (TDG2)，推测其为控制马铃薯叶片发育的候选基因.在模式植物拟南芥中共有四个TDG基因，主要参与脂质从内质网到叶绿体的运输[26,29].TDG1-TDG4这四个基因中任何一个基因的突变都会导致了三半乳糖基二酰甘油的积累(TGDG)[30].TDG2主要是通过其N端的跨膜结构域锚定在内质网上发挥功能[31].衣藻TDG2的突变呈现早衰现象，与对照相比TDG2基因被突变的衣藻寿命明显缩短，培养21天后，叶绿素含量降低，培养物变黄[32].

马铃薯叶片发育良好与否直接关系光合作用能力的强弱从而影响马铃薯产量高低.因而能够构建一个与马铃薯叶片发育相关的群体并且筛选候选基因对马铃薯育种具有重要意义.