致病疫霉保守效应子的初步鉴定和分析*

梁军， 贾玉鑫， 宫凡淇， 祝光涛

(云南师范大学 生命科学学院,马铃薯科学研究院，云南省马铃薯生物学重点实验室，云南省高校马铃薯生物学重点实验室，云南 昆明650500)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄属的一年生草本植物，在全世界内广泛种植.在我国粮食结构中，马铃薯是继小麦、水稻和玉米之后的第四大粮食作物[1].在马铃薯生长发育过程中，由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病(Late blight)严重影响马铃薯的生长和结薯.19世纪中期，由于欧洲地区晚疫病的大面积爆发，导致了爱尔兰大饥荒，至少100万人死亡[2].2009年，这种毁灭性的疾病导致了马铃薯全球产量降低了16%，对全球粮食安全造成了重大的威胁[3].因此研究马铃薯响应致病疫霉侵染的分子机制对于防治晚疫病、保障我国乃至世界的粮食安全具有重要意义.

在演化过程中，植物与病原菌进行着长期且持续的共进化斗争.植物防御过程中的第一道防线，称为病原相关分子模式引发的免疫反应(PAMP-triggered immunity，PTI).植物通过细胞表面的模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)，识别细菌的鞭毛蛋白FLG22，通过MAPK级联反应[4]，启动植物的第一道防御机制.FLG22鞭毛蛋白是微生物表面的一类高度保守的蛋白，在N端含有22个保守的氨基酸[5].在植物中，鞭毛蛋白受体(Flagellin sensitive 2，FLS2)被证明能够识别FLG22，进而起始PTI类型的免疫应答[6].植物通过激活MAPKs信号传导途径，提高活性氧水平，启动水杨酸和茉莉酸信号途径，关闭气孔，促细胞壁增厚等多种应答方式，提高自身对病原菌侵染的抵抗能力[7].病原菌为了能够进一步侵染植株，会向植物细胞内分泌效应子(Effector)，抑制植物的PTI反应，减弱植物的抗病性，增强自身侵染能力[8].RxLR效应子对晚疫病的侵染具有重要贡献，主要特征是N端含有一个15-25个疏水性氨基酸残基组成的信号肽，信号肽后是保守的Arg-x-Leu-Arg(RxLR)结构域，除此之外还含有多样且快速进化的C末端结构域[9].

在植物和病原菌共进化的过程中，植物进化出了第二道防线，称为效应子引发的免疫反应(Effector-triggered immunity，ETI).在与晚疫病的长期斗争中，植物进化出了含有核苷酸结合结构域(Nucleotide-binding domain，NB)和富含亮氨酸重复单元结构域(Leucine-rich repeat，LRR)的蛋白[10]，称为NB-LRR类R(Resistance)蛋白，通过直接或间接的方式识别RxLR型效应子，进而触发ETI，形成强烈的免疫反应，引起局部性的细胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)，这种反应也被称为过敏反应(Hypersensitive response，HR)[11].过敏反应是植物防卫反应的一种重要形式，在病原菌侵染的位置迅速导致一部分细胞坏死，阻止病原菌的进一步侵染[12].因此，分析致病疫霉侵染马铃薯时的效应子的表达情况并鉴定其中的保守效应子对于研究马铃薯抵御病原菌侵染的分子机制具有重要意义.

近年来，高通量测序技术在生物学研究上的应用越来越广泛，转录组测序(RNA-seq)是利用高通量测序技术，将生物细胞或某个组织在特定时期表达的mRNA、sRNA以及非编码RNA(ncRNA)进行全部测序分析，从而快速而全面的获取该物种在特定时期的所有转录信息.得到转录组信息后可以进行基因表达水平分析、差异表达基因分析、差异表达基因GO分类以及差异表达基因聚类分析等，为后续的研究提供大量的基因信息，作为研究的参考和依据.本研究通过对4种致病疫霉生理小种侵染的马铃薯叶片进行转录组测序，鉴定得到277个保守的RxLR型效应子.此外，通过分析马铃薯响应致病疫霉侵染的差异表达基因，初步表明马铃薯对不同生理小种侵染的响应机制存在很大差异.

1 材料与方法

1.1 实验材料

采用的马铃薯品种为Desiree，保存于云南师范大学马铃薯科学研究院.材料种植于云南师范大学马铃薯育种试验基地.

采用的致病疫霉生理小种由云南师范大学马铃薯科学研究院唐唯老师惠赠，分别采集于云南不同地区，编号为：124、SI、H6和88.保存于云南师范大学马铃薯科学研究院.

1.2 实验试剂

RNAprep Pure Plant Kit植物总RNA提取试剂盒(DP441)购自北京天根生化科技有限公司.黑麦培养基参照文献[13]进行了改进：60 g黑麦，加水煮沸2 h，用纱布过滤收集黑麦汁，加入20 g蔗糖，100 mL V8蔬菜汁，1 g CaCO3，13 g琼脂粉，调节pH至7.0，定容为1 L.高温高压灭菌后将培养基倾倒于直径9 cm的塑料培养皿中，用于培养致病疫霉.

1.3 实验方法

1.3.1 游动孢子收集

挑取致病疫霉的菌丝接种到新配制的黑麦培养基上，在培养箱中，18 ℃黑暗培养14 d，选取菌丝生长旺盛，状态良好的平板，加入适量无菌水，使用涂布棒轻轻地将孢子囊刮下来，收集孢子囊.在光学显微镜下观察孢子囊数目，调整孢子囊浓度约为1 × 105个/mL，4 ℃静置2～3 h，使孢子囊破裂，释放出游动孢子，用于接种在马铃薯叶片上.

1.3.2 离体叶片接菌实验

选取长势健康且无机械损伤的Desiree叶片进行离体接菌实验.吸取10 μL游动孢子悬浮液，接种于叶片背面，采用塑料薄膜封口，保持温度为20 ℃，相对湿度为90%以上.接种48 h后，用打孔器取下病斑位置的叶片，立即液氮速冻保存，随后用于提取RNA.

1.3.3 RNA提取

按照RNAprep Pure Plant Kit试剂盒说明书提取RNA，分别提取未接菌时的Desiree叶片和接菌48 h后的病斑位置叶片RNA，每个处理组和对照组各两个重复.将提取得到的RNA送至安诺优达基因科技(北京)有限公司进行转录组测序.

1.3.4 转录组测序及分析

采用illumina Novaseq 6000 测序平台对RNA样品中的mRNA进行建库测序.采用双端测序，读长150 bp，每个样品过滤后得到的有效数据不少于8 Gb.

使用Hisat2(v2.1.0)将测序得到的结果分别比对到马铃薯和致病疫霉的参考基因组上[14].使用StringTie(v1.3.3b)计算每个基因的FPKM[15].使用ballgown(v2.16.0)计算病原菌处理前后基因表达水平差异[16]，以上这些软件均使用默认参数运行.使用课题组编写的Python脚本为基因添加注释信息，用于后续的分析.使用Venny(v2.1)绘制基因表达的韦恩图(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/).使用ComplexHeatmap(v2.0.0)绘制基因表达的热图[17].

2 结果与分析

2.1 马铃薯叶片离体接菌

选取生长14 d的124、SI、88和H6致病疫霉，采用上述方法收集病原菌孢子囊，显微镜下观察如图所示(图1 A).4 ℃静置2～3 h后，释放出游动孢子.采集Desiree材料生长状况良好的叶片，放置于托盘内，吸取10 μL游动孢子接种到马铃薯叶片背面，使用塑料薄膜封口，48 h后产生明显的发病症状(图1 B和C).使用直径6 mm的打孔器取下病斑部位的叶片，进行RNA的提取.将提取获得的RNA交予测序公司进行mRNA转录组建库测序.

A：从培养皿上收集的致病疫霉孢子囊;B：接菌前的Desiree叶片;C：接菌48 h后Desiree叶片的表型

图1致病疫霉侵染前后Desiree叶片的表型

Fig.1The phenotypes of Desiree leaves before and after inoculation

2.2 致病疫霉侵染的转录组测序结果分析

2.2.1 致病疫霉转录组分析和保守RxLR效应子鉴定

使用Hisat2分别将124、SI、88、H6侵染48 h的测序数据比对回致病疫霉的参考基因组，获得reads在基因组上的比对信息.使用StringTie计算基因的FPKM，计算2个重复样品的平均FPKM作为转录本的表达量.使用课题组编写的Python脚本为转录本添加注释信息.

根据基因注释信息和表达量，挑选注释为RxLR且FPKM > 1的转录本作为在侵染过程中有表达的效应子.共鉴定到427个效应子在致病疫霉侵染过程中有表达，表明这些蛋白参与了抑制植物免疫反应的过程.其中124、88、SI和H6中分别有346，330，357和356个RxLR效应子表达.进一步分析表明，287个效应子在88和124中共有表达，88和H6共有的为298个，H6和SI共有的为316个，124和SI共有的为312个.在所有4种生理小种中共同表达的效应子为277个(图2 A).这个结果说明，在不同的生理小种侵染马铃薯叶片时，会分泌大量不同的RxLR效应子进入植物细胞，从侧面证实了致病疫霉生理小种的多样性.这其中277个效应子在4个小种中均表达，意味着这些效应子在抑制植物免疫反应时具有比较保守的功能.

A：侵染48 h后，不同生理小种中效应子表达情况;B：不同生理小种保守效应子的表达水平

图2不同致病疫霉生理小种中RxRL效应子的表达情况

Fig.2The expression of RxLR effectors in differentPhytophthorainfestansisolates

2.2.2 晚疫病菌RxLR型效应子表达水平分析

为了进一步分析保守效应子的表达水平，比较了277个保守效应子在不同病原菌中的表达量数据.使用ComplexHeatmap绘制基因表达的热图.结果显示(图2 B)，在4种生理小种中，共表达的效应子有着类似的表达模式：部分效应子在4种生理小种中表达量普遍较高(FPKM > 40)，而另一部分效应子在4种生理小种中表达量普遍偏低(FPKM < 10).这种不同生理小种基本一致的表达模式也进一步证实了这些效应子可能具有比较保守的生物学功能.

2.2.3 马铃薯响应致病疫霉侵染的差异表达基因分析

使用Hisat2将病原菌侵染前后的转录组测序结果比对回马铃薯参考基因组，使用StringTie计算转录本的FPKM作为转录本表达量，使用ballgown计算病原菌侵染前后的差异表达基因.挑选fold change≥2，P<0.05的基因作为响应病原菌侵染表达发生上调的基因；挑选fold change≤0.5，P<0.05的基因为下调表达基因.分别将124、SI、88和H6侵染后表达上调和下调的基因绘制韦恩图.

结果显示，4种生理小种侵染马铃薯48 h后，共有2 230个基因上调表达，2 556个基因下调表达(图3).其中88和124侵染马铃薯叶片时，共同上调表达的基因有49个，共同下调表达的基因有70个；124和H6侵染马铃薯叶片时，有27个基因表达水平同时上调，22个基因表达下调；H6和SI侵染马铃薯叶片时，共同响应的基因有29个，其中上调表达的19个，下调表达的10个；SI和88侵染马铃薯叶片时，4个基因的表达同时上调，2个基因的表达下调.这些结果表明，只有少数基因能同时响应2种生理小种的侵染，没有基因能同时响应4种生理小种的侵染；说明马铃薯在感受到不同病原菌侵染时，相应地调整了自身基因表达，进一步证明致病疫霉不同生理小种之间具有不同的侵染特性.

A：马铃薯响应病原菌侵染上调表达的基因；B：马铃薯响应病原菌侵染下调表达的基因

图3马铃薯中响应致病疫霉侵染的差异表达基因

Fig.3Differentially expressed genes in potato in response toPhytophthorainfestansinfection

3 讨 论

作为一种重要的块茎类粮食作物，世界上约13亿人以马铃薯作为主粮.威胁马铃薯生产最重要的病害之一是由致病疫霉所引起的马铃薯晚疫病.即使在近年，晚疫病依然严重威胁马铃薯的生产，2012年，甘肃省马铃薯晚疫病的爆发致使部分马铃薯产区绝收，大部分产区严重减产[18].

在晚疫病抗性研究中，陆续发现了一系列抗病基因(R基因).然而随着晚疫病菌的快速进化，含有R基因的品种很快被克服.近年来，越来越多的研究发现对植物体内的感病基因(S基因)进行编辑，能够使植物获得对病原菌的广谱抗性.Wang等[19]发现致病疫霉效应子Pi04089能够与马铃薯细胞中的RNA结合蛋白StKRBP1相互作用，将StKRBP1过表达能显著降低马铃薯的抗病性.相反对StKRBP1进行突变，阻断其与Pi04089的互作后，显著增强了马铃薯的抗病性.Boevink等[20]发现致病疫霉效应子Pi04314与宿主体内的PP1c互作，沉默PP1c基因后，马铃薯的抗病性显著增强.表明PP1c作为一种S基因，抑制了植物的免疫反应.鉴定S基因的第一步就是要获得致病疫霉中保守的效应子.2009年，致病疫霉参考基因组[21]的公布大大加快了这一进程.Brian等[21]研究发现，79个RxLR效应子在致病疫霉侵染马铃薯2～3 d后表达量显著增高.Yin等[22]对5种致病疫霉菌株游动孢子侵染马铃薯叶片12 h后的材料进行了深度测序，共分析得到了245个RxLR效应子，其中108个在所有5种致病疫霉菌株都有表达，进行序列多态性分析后，得到了18个序列保守的RxLR效应子，进一步研究发现SF12、SFI3和SFI4在所有被测菌株中高表达，表明它们在侵染植物的早期阶段具有潜在的重要功能.

研究通过高通量测序技术，分析了4种致病疫霉生理小种侵染后的马铃薯叶片转录组，共鉴定到427个RxLR效应子在病原菌侵染过程中表达，其中277个效应子在4个生理小种中均有表达(图2 A).对这些效应子的基因表达水平进行分析，表明其在不同生理小种中具有类似的表达模式(图2 B).这个结果为进一步寻找马铃薯中的保守S基因奠定了基础.此外，还进一步分析了马铃薯响应致病疫霉侵染的差异表基因.共鉴定到2 230个基因在病原菌侵染时表达上调，2 556个基因表达下调.通过相互比较，发现不同生理小种所诱导的差异表达基因存在很大不同(图3)，表明不同生理小种具有不同的侵染特性，使得马铃薯在应对病原菌侵染时表现出不同的基因表达模式，这也从侧面说明了致病疫霉生理小种的多样性以及研究马铃薯抵御致病疫霉侵染的复杂性和困难性.