联合细胞膜片和自组装多肽技术构建一种新型BMSCs膜片-RADA16组织工程复合体的研究

李豆豆 周维维 王蕾 刘露 李春绒 刘思麟 曹猛

骨组织工程是组织工程学中的一个分支，它主要利用工程学的原理和方法将种子细胞复合于生物支架上形成细胞-支架复合体，最终移植于缺损处达到修复再生的目的[1]。此外，细胞膜片技术(cell sheet technology，CST)，也称细胞片层技术，是种子细胞利用自身的细胞外基质(ECM)形成的数层致密细胞聚合体，也是目前骨组织工程的常用方法之一[2]。

对于理想的骨组织工程支架材料，有利于细胞粘附、增殖和分化的表面性能、合适的空隙、以及良好的生物安全性等均是十分重要的影响因素[3-4]。自组装多肽(Self-assembled peptides，SAP)是以多肽为基本组成单元，依靠多肽分子天然自组装得到的新颖支架材料。RADA16(AcN-RADARADARADARADA-CNH2)是一种具有纳米级纤维的自组装多肽凝胶，其纤维空隙、简单的氨基酸成分和充分的含水量，更接近天然细胞外基质，可作为细胞支架提供理想的三维生长环境[5-8]。

本实验拟构建BMSCs膜片-RADA16复合体，探究复合体对细胞的增殖情况以及成骨分化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要材料、仪器

实验动物： 8 周龄SD大鼠。 α-MEM培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(杭州四季青)；胰蛋白酶(Sigma，美国)； RADA16水凝胶 (Corning，美国)；罗丹明标记的鬼笔环肽(Cytoskeleton，美国)；地塞米松、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、抗坏血酸、胰岛素、油红O、茜素红(Sigma-Aldrich，美国)；BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒(康为世纪)；CCK-8试剂盒(南京恩晶生物)；扫描电子显微镜(JSM-6700F，日本)；激光扫描共聚焦显微镜(Olympus Fluoview FV1000，日本)；反转录和定量 PCR试剂盒(Ta) (Ka) (Ra，日本)；实时定量PCR仪(Prime Q，英国)；SynergyTMHT酶联免疫检测仪(BioTek, 美国)。

1.2 BMSC的分离培养和鉴定

SD大鼠脱颈处死，无菌条件下取股骨及胫骨，剃除肌肉。剪掉股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔，用添加青、链霉素的α-MEM培养基冲出骨髓，轻轻吹打均匀，接种于25 cm2培养瓶中，置37 ℃、 5% CO2和饱和湿度的培养箱中培养。

流式细胞仪检测细胞表面标记： 细胞传至P3代，调整细胞数量至每EP管1×106个， 各管依次加入单克隆抗体CD29、CD34、CD45、CD90。同时每管样品设立同型阴性对照。避光冰上孵育45 min，用500 μl PBS(含1%BSA)重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。

BMSCs体外诱导分化：选择P3代BMSCs，以3×105个/孔的浓度接种于6孔培养板，待细胞贴壁生长至密度达80%时，在各孔的完全培养液中分别加入下列诱导剂：①成脂细胞诱导剂(1 mmol/L地塞米松、 10 mg/L胰岛素、 50 mmol/L IBMX、 吲哚美辛 0.2 mmol/L)。②成骨细胞诱导剂(1 mmol/L地塞米松、 1 mol/L β-甘油磷酸钠、 50 mmol/L抗坏血酸)。成脂细胞诱导剂诱导14 d后，经4%多聚甲醛固定，对诱导分化的脂肪细胞进行油红O染色；成骨细胞诱导剂诱导7 d和21 d后，经4%多聚甲醛固定，对诱导分化的成骨细胞分别进行BCIP/NBT碱性磷酸酶和茜素红染色。

1.3 BMSC膜片和BMSC-RADA16复合体的构建

选择P3代细胞，以5×105个/孔的浓度接种于6孔培养板，待细胞贴壁生长至密度达90%～100%时，在完全培养基中加入成膜诱导液(50 μg/ml的抗坏血酸)。

超声波水浴降低RADA16凝胶粘度，用无菌去离子水稀释原液1%(w/v)至0.25%，以250 μl/孔的体积加入24 孔培养板。小心缓慢地在凝胶表面加入培养基(500 μl/孔加入24 孔培养板)促进凝胶化。在孵箱中孵育，第一小时内每隔1、 10、 30 min小心更换培养基以平衡凝胶pH，置于孵箱中过夜。培养好的BMSCs膜片包裹凝胶支架，每3 天更换培养液。

1.4 扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察形貌

将BMSCs膜片和BMSCs膜片-RADA16复合体用 3%戊二醛固定过夜，乙醇梯度脱水、冷冻干燥后喷金，扫描电镜观察表面的微细结构。

在 24 孔培养板中放置盖玻片，BMSCs膜片和BMSCs膜片-RADA16复合体培养14 d 后， 4% 多聚醛固定 10 min，PBS 清洗30 s，再用0.5% Triton X-100 处理 5 min。 加入200 μl 100 nm的鬼笔环肽(5 U/ml) 溶液浸没样本，黑暗中室温孵育 30 min，用 100 nm 的 DAPI 染色 5 min。滴加抗荧光淬灭封片液封片，激光共聚焦荧光显微镜观察并拍照。

1.5 CCK-8测定生长曲线

选用P3代细胞，以2×104个/孔的密度接种于24 孔培养板，成膜后继续培养，每日在其中一板中，加入1 ml培养基和 100 μl CCK-8，避光置入 37 ℃ 培养箱，培养 4 h。每孔吸出100 μl转移至96 孔板，用酶联免疫检测仪检测吸光度(A)值，激发光波长为 495 nm。记录各孔吸光值、求其均值并绘制细胞生长曲线。

1.6 Real-Time PCR测定细胞的成骨分化

BMSCs膜片和BMSCs膜片-RADA16复合体以成骨诱导培养基培养。在第 3、 7、 14 天时将各组培养基去除后，用RNAiso Plus提取细胞总RNA，以 20 μl体系将RNA反转录为 cDNA。反应条件为：37 ℃ 15 min； 85 ℃ 5 s； 4 ℃。引物根据 NCBI上 Primer-BLAST 设计并经过比对，由北京奥科合成，具体见表 1。结果以 Ct 值表示，以GAPDH为内参照，以2-ΔΔCt计算基因相对表达量。

1.7 统计学分析

采用SPSS 17.0 对数据进行统计分析，两独立样本比较用成组t检验，检验水准为α=0.05,P<0.05为存在显著性差异。

2 结 果

2.1 BMSCs的鉴定

流式细胞仪检测结果显示： P3代 BMSCs均一表达CD29，CD90，阳性率分别为99.1%、 99.8%；而CD34、 CD45呈阴性，阳性率分别为1.0%、 1.5%(图 1)。BMSCs成脂诱导分化鉴定：诱导而成的脂肪细胞累积脂质，脂滴变大合并呈串珠状。经油红O染色呈鲜红色 (图 2A)。BMSCs成骨诱导分化鉴定：碱性磷酸酶染色可见细胞膜及胞浆内矿化颗粒沉积，染色呈蓝黑色、深染颗粒(图 2B)。茜素红染色矿化结节呈现红褐色(图 2C)。以上结果说明培养细BMSCs为骨髓间充质干细胞。

表 1 PT-PCR引物Tab 1 Primers for RT-PCR

2.2 BMSCs膜片和BMSCs-RADA16复合体的形态学观察

BMSCs膜片、RADA16凝胶支架以及复合体大体观如图 3。扫描电镜观察结果显示：膜片细胞生长状态良好，突触清晰，有部分细胞正在分裂， 并可见细胞间桥(图 4A和4B)；膜片与支架材料共培养后，细胞在材料上伸出触角，粘附到支架材料上，并有部分触角向支架材料孔隙内生长(图 4C)。电镜可见支架材料疏松多孔的表面形态(图 4D)。

图 1 BMSCs流式细胞仪鉴定结果Fig 1 Identification of BMSCs by flow cytometer

A： 油红O染色(×20)； B： BCIP/NBT碱性磷酸酶(×4)； C： 茜素红染色(×4)图 2 BMSCs诱导分化观察A: Oil red O staining(×20); B: BCIP/NBT alkaline phosphatase(×4); C: Alizarin red staining(×4)Fig 2 Induced differentiation of BMSCs

激光共聚焦显微镜结果显示：细胞核被 DAPI 染料染成蓝色，细胞骨架被罗丹明-鬼笔环肽染料染成红色。 2 组细胞生长旺盛，可以观察到粗大的细胞骨架，其中BMSCs-RADA16复合体组细胞伸展性更好，说明细胞活性更好(图 5)。

2.3 CCK-8测定生长曲线

细胞生长曲线结果如图 6 显示。经统计学分析： 第1～2 天， 2 组间无显著性差异(P>0.05)； 第3～8 天， BMSCs-RADA16复合体组比BMSCs膜片组细胞数量多，且两者之间有显著性差异(P<0.05)。

2.4 Real-Time PCR测定成骨表达水平

PCR结果如图 7所示： 在诱导3、 7、 14 d时， 复合体中成骨相关基因ALP、OCN、COL-1、RUNX2总体趋势呈上升水平，提示与BMSCs膜片相比，复合体中BMSCs的成骨基因表达量显著升高。

图 3 膜片、支架及复合体大体观Fig 3 General view of the cell sheet, scaffold and complex

A: ×1 000; B: ×5 000; C: ×10 000; D: ×20 000图 4 BMSCs和支架形貌(SEM)Fig 4 Morphology of BMSCs and scaffold(SEM)

图 5 DAPI 和Rhodamine phalloidin染色(LCM, ×200)Fig 5 DAPI and Rhodamine phalloidin staining (LCM, ×200)

图 6 BMSCs曲线Fig 6 Growth Curves of BMSCs

3 讨 论

组织工程是现代修复重建医学领域的新思路， 组织工程两大关键要素是种子细胞和生物支架。

目前，研究学者们主要通过应用种子细胞构建细胞膜片或将细胞与支架材料相复合的方法来制备骨组织移植物。细胞膜片是一种细胞聚合体，在高密度接种细胞后， 通过刺激细胞分泌外基质而形成数层致密的细胞片，具有一定的韧性和强度[9]。细胞膜片虽然对小面积骨缺损有一定的效果，但是当缺损较大时，往往因为细胞自组装聚合能力的限制及中心营养供应等问题难以构建大体积细胞膜片移植物修复大面积的骨缺损[2]。另外，单纯的细胞膜片虽然可塑性强，但机械强度欠佳，常需与其他支架材料复合来提供机械支撑的作用[9]。

图 7 ALP，OCN，COL-1，RUNX2成骨基因相对表达量(RT-PCR)Fig 7 The relative expression levels of ALP, OCN, COL-1 and RUNX2(RT-PCR)

随着组织工程材料的发展，细胞与支架材料复合来修复骨缺损也得到广泛应用。Villa等[10]将小鼠的 BMSCs 接种到胶原-羟基磷灰石支架材料上修复颅骨缺损，结果发现移植后3 周，可观察到新骨形成。 有学者将细胞膜片与聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)等支架用于组织工程中，取得了一定的效果[11-12]。但有研究表明[13]， 当PLGA降解时会产生酸性环境， 移植区域产生的酸性 pH不仅会阻碍细胞向 PLGA 支架迁移，还会导致细胞活性的显著降低。寻找合适的骨组织工程支架材料，将细胞膜片与支架材料结合用于再生医学，找到可能更优的组织工程方法，是本实验的出发点。

自组装多肽纳米纤维支架(Self-assembled peptides nanofiber scaffolds，SAPNS) 是一类具有三维网状结构的新型生物支架，其结构、生物功能、机械力学等特性类似天然细胞外基质，并选择性调控种子细胞生物学行为。生物大分子的基本特征之一是分子自组装，通过自组装形成水凝胶可以有效的模拟精细的生物和天然大分子物质，是真正意义上的仿生材料。RADA16 是两亲性多肽(amphiphilic peptides， PAs)，在改变多肽溶液pH值或加入碱性阳离子的情况下，自组装生成的一类具有三维网状结构的新型生物支架[14]。

多肽内活性片段的含量约为5%，含水量超过99%，高含水量、大表面积、高孔隙率等特性使 SAPNS 以类似天然 ECM的形式包绕种子细胞，利于营养物质、活性分子及氧气等弥散，且利于细胞黏附、增殖、迁移和分化[15-17]。本实验中通过倒置相差显微镜、扫描电镜和激光共聚焦显微镜等多层面观察到细胞在支架材料上生长状态良好；通过增殖实验显示BMSCs与RADA16凝胶支架结合初期细胞数量略低，这可能与环境改变和细胞适应有关，后期增殖速度增高并超过单纯BMSCs膜片，这些均表明RADA16多肽纳米纤维支架材料的生物相容性良好，对细胞毒性低。此外，研究表明[18]，在成骨诱导液的培养条件下，RADA16多肽支架材料中骨髓间充质干细胞的钙含量和骨钙素含量随着培养时间呈现上升趋势，矿化的细胞外基质能够遍布整个三维RADA16支架材料。该研究结果说明，RADA16可以作为骨髓间充质干细胞的载体材料用于骨组织工程研究。本实验通过PCR技术对成骨相关的早期因子、晚期因子以及转录相关因子的检测，显示BMSCs膜片-RADA16中细胞的成骨能力比单纯BMSCs膜片高，这可能是因为凝胶创造了细胞生长良好的微环境，有利于细胞间生物活性信息分子的交流和传递。

BMSCs膜片-RADA16复合体在一定程度上克服了单纯BMSCs膜片操作性能差和机械性能不佳等问题；同时RADA16形成的水凝胶支架在体内最终降解为小分子多肽和氨基酸，有良好的生物相容性；RADA16比蛋白质有更加规整的氨基酸序列和多样的氨基酸残基种类，并可在其末端连接不同功能的多肽，作用在不同的靶细胞发挥特定的功能。关于BMSCs膜片-RADA16复合体的性能还需要更多的体内研究验证。

4 结 论

自组装多肽RADA16是一种良好的组织工程支架材料，新型的BMSCs膜片-RADA16复合体可能作为一种植入体用于组织工程中。