臭氧水对口臭相关细菌的体外抑制效果研究

江静 黎春晖 聂敏海

口臭主要由口腔微生物(革兰氏阴性厌氧菌占多数)对口腔中滞留物质腐败分解引起[1]。同时，口臭给就诊患者带来严重的心理负担和社交障碍。研究表明，口臭主要是由牙周致病菌内含硫氨基酸的代谢产物增加所致，如硫化氢(H2S)、二甲硫醇[(CH3)2S]、甲硫醇(CH3SH)等[2]。口臭致病菌主要是厌氧菌，如牙龈卟啉菌(porphyromonasgingivalis,Pg)、中间普氏菌(prevotellaintermedia,Pi)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)等[3]。资料显示，超过80%的口臭患者通常是由多种菌株混合感染所致，且这类菌株在理化特性上极为相似[4]。因此，在研究患者口腔中口臭致病菌时，应先了解感染菌群，有利于后期用药。

口臭就诊患者没有年龄和性别的区分，病例的分布范围也较广。因此，临床用药也较为广泛，最终细菌对某些临床药物产生耐药性。臭氧水具有广谱杀菌作用，可能具有清除口臭的作用。同时，臭氧水杀菌基本无毒副作用，为临床上替代抗生素提供新思路。为此，本课题组从西南医科大学附属口腔医院(2017 年)收集到3 株临床分离株，探讨臭氧水的杀菌作用，以期达到除口臭的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料与仪器

1.1.1 试验菌株 牙龈卟啉单胞菌(Pg)、具核梭杆菌(Fn)及中间普氏菌(Pi)来自2017 年西南医科大学附属口腔医院病人口腔中的分离株。

1.1.2 主要仪器 臭氧发生器(GX-188型，成都肯格王三氧电器设备有限公司)； 洁净工作台(SW-CJ-2F，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)； 厌氧培养箱(YQX-Ⅱ，上海精其仪器有限公司)； 倒置生物显微镜(AE31，麦克奥迪实业集团有限公司)； 酶标仪(Multlskan，赛默飞世尔仪器有限公司， 美国)。

1.1.3 试剂 臭氧测定试剂盒(Lot：8304172， 广东环凯微生物科技有限公司)；革兰氏染液(规格10 ml×4)；人工唾液(XH-002， 东莞市誉扬检测仪器有限公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；BHI血琼脂平板(广东环微生物科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌复苏及传代 将冻存管(菌株)表面用75%乙醇擦拭后移入洁净工作台，分别复苏后各取100 μl到血平板上涂布培养。置入厌氧培养箱中，设置温度为37 ℃(10% CO2， 80% N2， 10% H2)。培养3 d后，分别挑取具Fn、Pg、Pi单菌落进行扩增，收集菌体进行试验。

1.2.2 革兰氏染色鉴定 用吸水纸将载玻片擦干，在玻片上滴10 μl生理盐水，接种环灼烧，待其冷却后，挑取单个菌落均匀涂于玻片的生理盐水上，待其自然干燥。再通过固定、95%乙醇染色、脱色、复染等，油镜头下观察菌体形态。

1.2.3 PCR鉴定 DNA提取：按试剂盒说明书操作。PCR扩增：引物序列见表 1。

1.2.4 臭氧水的制备及测定方法 在环境温度为25 ℃的条件下，将臭氧发生器产生的臭氧气体以多孔砂棒通入盛有250 ml灭菌蒸馏水的具塞三角瓶中，并分别于臭氧水产生的每隔2 min 即2、 4、 6 min……关闭发生器，再用碘量法分别测定各个时间点所对应的臭氧水中臭氧浓度，并测得该臭氧发生器开机所能获得的最大臭氧水浓度以及获得最大臭氧水浓度所需的时间。为减小实验误差，此实验中所涉及的测量步骤均需重复3 次，实验结果取3 次的平均值。

表 1 3 株菌的扩增引物序列Tab 1 The amplification primer sequences of 3 strains of bacteria

1.2.5 臭氧水抑菌试验 取离心管并按如下方法加入试剂：实验组离心管中分别加入浓度为0.2、 0.1、 0.05 mg/L的臭氧水4.5 ml，阴性对照组离心管中加入蒸馏水4.5 ml，再分别各组的离心管中加入对应细菌编号的0.5 ml菌悬液，分别作用30 s和60 s，适当稀释后取10 μl接种于实验用BHI血琼脂培养基。在厌氧环境中(80% N2，10% H2，10% CO2)培养48 h后进行菌落数CFU计数，计算出抑菌率，观察在30 s和60 s作用时间下3 种不同浓度臭氧水的体外抑菌效果。重复实验3 次，实验结果取3 次的均值。采用人工唾液模拟正常口腔环境，同样条件下，观察臭氧水的抑菌情况。本实验结果重复3 次，取平均值。

2 结 果

2.1 革兰染色结果

3 株菌经革兰染色后，油镜下观察可见中间普氏菌(图 1A)为革兰阴性球杆菌，牙龈卟啉单胞菌(图 1B)为革兰阴性短杆菌，具核梭杆菌(图 1C)为革兰阴性梭状杆菌，形态特点与3 株菌的理论形态相符。

2.2 PCR鉴定结果

3 株菌经PCR鉴定，结果显示中间普氏菌，牙龈卟啉菌，具核梭杆菌分别在105、 194、 175 bp左右有一条清晰的条带(图 2)，与理论相符。

2.3 臭氧水浓度测定结果

在实验室当时室温下，采用目前的臭氧水制备条件下制备所得的臭氧水的最大浓度为0.2 mg/L, 对其进行对倍稀释，获得3 个浓度分别为0.2、 0.1、 0.05 mg/L的臭氧水备用。

2.4 臭氧水抑菌试验结果

图 1 3 种细菌的形态(×1 000)Fig 1 The morphology of the 3 bacteria stains

(×1 000)

1： 中间普氏菌； 2： 牙龈卟啉单胞菌； 3： 具核梭杆菌图 2 Pi、 Pg、 Fn的16S rDNA PCR条带谱图结果Lane 1: Pi; Lane 2: Pg; Lane 3: FnFig 2 The 16SrDNA PCR bands of the 3 bacteria strans

臭氧水抑菌结果显示，臭氧水在臭氧浓度在0.05、0.1、 0.2 mg/L 3 个浓度时对中间普氏菌，牙龈卟啉菌及具核梭杆菌均具有较好的抑制作用， 随着臭氧浓度的降低，臭氧水对3 株菌的抑制效果也减弱，具有浓度依赖关系(表 2)。

2.5 人工唾液干扰臭氧水抑菌试验结果

由表 3可知，在唾液的存在情况下，臭氧水在臭氧浓度为0.2、 0.1、 0.05 mg/L的臭氧水时对中间普氏菌，牙龈卟啉菌及具核梭杆菌均具有一定的抑制作用，同时随着臭氧浓度的降低，臭氧水对3 株菌的抑制效果也减弱，具有浓度依赖关系。但抑菌作用较单纯臭氧水相比显著降低。

表 2 3 株菌的臭氧水抑菌试验结果Tab 2 The results of ozone water suppression test of 3 bacteria strains

表 3 人工唾液干扰臭氧水抑菌试验结果Tab 3 The results of inhibition test of ozone water interfered by artificial saliva

3 讨 论

研究发现，牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌及中间普氏菌等与口臭密切相关，郭兴怀等[5]抽取43 例口臭患者细菌样本，检测发现主要是牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌等构成， 且主要牙周致病菌与口臭程度存在着高度相关性。肖晗等[6]发现，具核梭杆菌通过刺激IL-6的产生促进食管癌细胞的增殖。具核梭杆菌感染可导致肠胃炎，主要是该菌株诱导肠上皮细胞Caco-2凋亡，其具体机制可能与GADD34及GADD153基因表达转录水平上调和AKT磷酸化下调密切相关[7]。中间普氏菌是产黑色素类革兰氏阴性厌氧杆菌，没有芽孢，是口臭患者十分常见的病原微生物[8]。潘亚萍等[9]通过细菌混合培养发现，口臭患者口腔里的中间普氏菌变形链球菌与、血链球菌呈拮抗关系，与伴放线放线杆菌和具核梭杆菌呈共生关系。本课题基于3 株菌的严重危害性和普遍性，以其为研究对象，进行深入探讨。

抗生素可以有效杀死口臭致病菌，达到清除口臭的目的。但近年来，凸显的耐药性问题让不少医务人员束手无策。因此，抗生素替代产品的挖掘任重道远。研究表明[10]，臭氧可以杀灭口腔患者中的部分病原微生物，且当臭氧水浓度达到1.3 mg/L时，作用120 s后，对中间普雷沃菌杀菌率可达到100%。臭氧主要是依靠其强氧化性破坏细菌细胞内核酸，如嘌呤和嘧啶，破坏DNA复制，不会产生耐药性。本研究结果发现，臭氧水具有降低口臭的作用。当臭氧水浓度在0.05、 0.1、 0.2 mg/L时对3 种菌均具有较好的抑制作用，且随着臭氧浓度的升高，抑制作用加强， 60 s作用效果比30 s强。臭氧水对口臭厌氧菌的作用时间是否与抑制率成线性关系，还需进一步研究证实。

本研究发现，当用人工唾液来模拟口腔环境时，臭氧水抑菌作用降低。证明临床应用上，臭氧水还需要进一步改进。抑菌作用下降可能与人工唾液中的还原性金属离子、缓冲液存在等有关，也可能与人工唾液的pH值、唾液流率及微观成分的变化有关。本课题组将进一步通过临床试验来加以探索和研究。

4 结 论

臭氧水能够对口臭相关细菌产生抑制作用，降低口臭。 0.2 mg/L和0.1 mg/L的臭氧水溶液对3 种菌的抑制效果均明显高于0.05 mg/L的臭氧水溶液对3 株菌的抑制效果，临床上为达到良好的治疗效果，应使用浓度≥0.1 mg/L的臭氧水溶液，且作用时间以达到60 s为宜。但实际应用中，还可能存在不少缺陷。因此，需要进一步深入研究。