光电二极管阵列检测器在桔汁分析中的应用

2019-03-05张克贤孙勇民黄艳玲张轶斌

天津科技 2019年2期

张克贤，孙勇民，黄艳玲，张轶斌

(天津现代职业技术学院天津300350)

光电二极管阵列检测器是高效液相色谱近年来发展的新技术，它的开发和应用使得高效液相色谱技术不仅能够进行分离定量，而且具备光谱扫描、波长选择、获得色谱和光谱的三维谱图、定性以及色谱峰纯度判断等功能。

光电二极管阵列检测器的工作原理是用一组光电二极管同时检测透过样品的所有波长紫外光和可见光，与普通的紫外检测器不同的是，进入流动池的光不再是单色光。光源经一系列光学反射镜进入流动池，从流动池出来的光再经分光系统、狭缝照射到二极管阵列装置上，数据收集系统实时记录下组分的光谱吸收，从而获得特定组分的结构信息，得到色谱保留时间、光谱波长和峰强度值的三维的立体谱图。因此，在结果中既可以察看各波长下的色谱图又可以察看各保留时间下的光谱图。光电二极管阵列检测器-高效液相色谱技术在食品、药品和农药残留等分析中应用广泛，如：利用高效液相色谱-二极管阵列检测器法分析饮料和蜜柚中维生素C 和光谱定性，测定食品添加剂苯甲酸含量，检测柑橘果汁中12 种多甲氧基黄酮、类黄酮物质等。

本文用光电二极管阵列检测器-高效液相色谱仪分析纯桔汁的类黄酮成分并定性和定量，利用光电二极管阵列检测器技术，对纯桔汁进行光谱扫描、波长选择，获得色谱和光谱的三维谱图并进行色谱峰纯度判断，定性类黄酮中的橙皮苷并以纯桔汁的橙皮苷为基准峰定量规定含桔汁饮料的桔汁含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

LC-20AD 型岛津高效液相色谱仪，带有Prominence SPD-M20A 型二极管阵列检测器，SIL-20A 型自动进样器，Prominence LC-20AD 型泵2 台，CTO-20A 型柱温箱，岛津技迩(上海)商贸公司WondaSil C18 Superb(250 mm×4.6 mm，5 μm)反相色谱柱和LabSolutions Essentia 工作站。济南清川仪器有限有公司流动相过滤装置(QC-01 型真空泵和玻璃滤瓶一套)，0.22 μm 水型和溶剂型滤膜。江苏省昆山市超生仪器有限公司KQ-100VDV 型双频数控超声波清洗器。针筒式滤膜过滤器[0.22 μm(水系)和0.22 μm(有机系)]和5～10 mL 注射器。德国艾本德公司5804R 型高速离心机。

岛津SPD-M20A 具有512 个光电二极管，光源为氘灯+钨灯，光谱带宽为1.2 nm(高分辨方式，8 nm高灵敏度方式)，波长准确度为±1 nm，波长精密度为±0.1 nm，检测波长范围190～800 nm。通过PDA数据可以建立一次进样纯化中适合多个不同吸收特性的样品制备分离方法。

1.2 试剂和材料

橙皮苷(纯度96.2%，中国食品药品检定研究院)，乙腈(HPLC 色谱纯，天津市起连兴化学品有限公司)，冰乙酸(HPLC 色谱纯，天津市起连兴化学品有限公司)，甲醇(HPLC 色谱纯，天津市起连兴化学品有限公司)，纯鲜榨桔汁(天津山海关饮料有限公司提供)，实验用水为经过Milli-Q Adwantage A10 型超纯水机过滤后的超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

利用同一批次纯鲜榨桔汁由天津山海关饮料有限公司制备浓度为3%、5%、7%、10%、20%的碳酸型桔汁饮料，然后将该纯鲜榨桔汁用超纯水配成10%～80%样品(纯鲜榨桔汁配制前振荡、摇匀，保证桔汁均匀一致再进行配制)，分别移取上述样品25 mL 于50 mL 容量瓶中用乙腈定容成50 mL，同样配制纯鲜榨桔汁。将样品和溶剂配伍后经超声脱气，再分别移取6～7 mL 于10 mL 离心试管中，离心5 min 后取上层清液，经0.22 μm 针筒式滤膜过滤器过滤，备用。

1.3.2 标准溶液的配制

用精度0.1 mg 的电子天平称取橙皮苷标准品0.025 6 g置于50.00 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并定容。如果溶解中较困难需用超声波进行超声溶解后再定容。该定容物为500 mg/L 的新橙皮苷储备液，根据标准曲线需要逐级稀释成不同浓度的使用液。

1.3.3 仪器条件确定

优化后的色谱条件为：以岛津技迩(上海)商贸公司WondaSil C18 Superb(250 mm×4.6 mm，5 μm)反相色谱柱为分析柱，0.2%乙酸水溶液和乙腈作为流动相，流速为1.0 mL/min，进样30 μL，梯度洗脱(洗脱程序见表1)，柱温40 ℃，DAD 检测器在190～800 nm 检测橙皮苷化合物。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure for mobile phase

1.3.4 纯鲜榨桔汁和橙皮苷标准品的三维谱图

将样品制备纯鲜榨桔汁和橙皮苷标准品的储备液按照流动相梯度洗脱程序进行二极管阵列检测器-高效液相色谱分析，通过3D 视图得到它们的色谱保留时间、光谱波长和峰强度值的三维立体谱图(见图1 和图2)。二极管阵列检测器-高效液相色谱可以提供全波长的色谱图，包括单波长色谱图、任意2 个波长的吸收比色谱图、波长时间程序色谱图、最大吸收波长色谱图以及总体吸收色谱图，其中最大吸收波长色谱图为灵敏度最高的检测方式，而总体吸收色谱图为定量重复性最好的方法。

图1 橙皮苷标准品的色谱、光谱三维谱图Fig.1 Chromatogram and three-dimensional spectrum of hesperidin standard

图2 纯鲜榨桔汁的色谱、光谱三维谱图Fig.2 Chromatogram and three-dimensional spectrum of pure fresh orange juice

1.3.5 纯鲜榨桔汁和橙皮苷标准品的色谱图

将纯鲜榨桔汁和橙皮苷标准品的储备液按照流动相梯度洗脱程序进行二极管阵列检测器-高效液相色谱分析，同时得到的色谱图在波长190～800 nm 范围任一波长条件下均进行了色谱数据采集，当需要某一波长色谱图时，输入波长即可显示该波长条件下的色谱图。图3 和图4 为某波长的色谱图。

图3 某一波长的纯鲜榨桔汁的HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of pure fresh orange juice at a wavelenth

图4 某一波长的橙皮苷标准品的HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of hesperidin standard at a wavelength

1.3.6 纯鲜榨桔汁和橙皮苷标准品的光谱视图

二极管阵列检测器进行数据采集时，采集色谱分离锋的同时进行光谱波长190～800 nm 范围的扫描并记录数据，获得光谱视图见图5 和图6(图5 为橙皮苷标准品光谱视图，图6 为纯鲜榨桔汁中橙皮苷峰的光谱视图)。因为类黄酮在紫外波长范围有吸收，而可见光部分没有吸收，所以截取光谱视图波长区间为190～400 nm。

图5 橙皮苷标准品光谱视图Fig.5 Spectroscopic view of hesperidin standard

图6 纯鲜榨桔汁中橙皮苷峰的光谱视图Fig.6 Spectroscopic view of hesperidin in pure fresh orange juice

2 结果与分析

2.1 标样橙皮苷波长的选择

普通紫外检测器液相条件的波长选择通过紫外分光光度计扫描选择最大吸收波长后，将该吸收波长设定紫外检测器进行HPLC 分析测试，其中的缺陷是这个最大吸收波长为混合组分的最大吸收波长，而二极管阵列检测器液相可以分别对各个峰或各个组分进行最大吸收波长的选择。例如图5 和图6：图5为橙皮苷标准品光谱视图，图6 为纯鲜榨桔汁中橙皮苷峰的光谱视图，其最大吸收波长均为283 nm。选择最大吸收波长达到可以进行灵敏度最高的检测，因此二极管阵列检测器-高效液相色谱不仅包括了所有紫外检测器液相色谱仪的功能，还可完全代替紫外检测器进行HPLC 分析。

另外，通过记录不同吸收波长色谱图并平铺谱图，记录选定峰的强度值与吸收波长对应便可以得到该峰的最大吸收波长，见图7、表2 和图8。图7 为不同吸收波长色谱图并多谱图排列，显示保留时间、波长和峰的强度值等信息；表2 记录波长与峰强度的对应数值；图8 为波长与峰强度值散点示意图。

图7 橙皮苷标准品不同波长的色谱图Fig.7 Chromatogram of hesperidin standard at different wavelengths

表2 不同波长检测出色谱图对应的强度值Tab.2 Different wavelengths to detect the corresponding intensity values of excellent spectra

图8 橙皮苷标准品波长与峰强度值散点示意图Fig.8 Sketch map of dispersion of hesperidin standard wavelength and peak intensity

2.2 鲜榨桔汁中橙皮苷成分定性

将经过离心、超声脱气和过滤好的鲜榨桔汁和乙腈混合物(体积比为1∶1)，转移到自动进样器样品瓶中，同样制备新橙皮苷储备液转移到自动进样器样品瓶中，按照上述色谱条件进行色谱分析。桔汁中橙皮苷定性采用保留时间和样品中加入橙皮苷标准物后某一峰增高的方法完成，见图3、图4 和图9。图3鲜榨桔汁与图 4 中橙皮苷标准品保留时间约17.7 min 相对应；图9 中加入橙皮苷内标物该峰明显增高，说明该峰为样品中橙皮苷成分。

图9 鲜榨桔汁加入橙皮苷标准品的色谱图Fig.9 Chromatogram of standard orange juice added hesperidin standard

2.3 鲜榨桔汁中橙皮苷色谱峰纯度判断

紫外检测器液相不能进行色谱峰纯度判断，而二极管阵列检测器液相可以进行色谱峰纯度判断，见图10 和图11。纯度视图中峰纯度阈值达到该峰纯度要求，不受噪音影响，峰轮廓图也无噪音影响。

2.4 标准曲线的绘制

将橙皮苷储备液进行不同浓度梯度稀释，配制5、10、15、20 mg/L 的标准使用液并进行过滤，在相同仪器条件下进行色谱分析，以橙皮苷标准品浓度为横坐标，以浓度对应峰面曲积为纵坐标作标准曲线(图12)，得到回归方程：y＝32 473x，回归系数为0.998 2。未知样经过色谱分析，通过峰面积利用该标准线即可求出浓度。

图10 橙皮苷标准品的峰纯度图Fig.10 Peak purity map of hesperidin standard

图11 橙皮苷标准品的峰轮廓图Fig.11 Peak profile of hesperidin standard

图12 橙皮苷标准曲线Fig.12 Standard curve of hesperidin

2.5 桔汁含量计算

原桔汁纯品在相同仪器条件下进行色谱分析，得到原果汁纯品的橙皮苷HPLC 峰面积，记为S纯，根据标准曲线计算出原果汁中的橙皮苷含量C纯。利用同一批次原果汁纯品配制的不同浓度的桔汁样品，进行相同条件分析，分别得到各个不同浓度桔汁样品的HPLC 峰面积，同样分别计算橙皮苷浓度。

以稀释样橙皮苷浓度除以纯样橙皮苷浓度得到配制橙汁含量，计算公式如下：

式中：Xi为桔汁含量，%；Pi为稀橙皮苷含量，mg/L；P纯为纯样新橙皮苷含量，mg/L；Si为稀释样新橙皮苷HPLC 峰面积；Si纯为纯样橙皮苷HPLC 峰面积(当测定中使用同一橙皮苷标准曲线时可以简化算式用橙皮苷HPLC 峰面积直接计算)。

2.6 不同含量桔汁及桔汁饮料测定结果及其与国标法对比

根据国标GB/T 12143—2008 方法，检测了天津山海关饮料有限公司制备的浓度为3%、5%、7%、10%、20%的碳酸型桔汁饮料和该纯鲜榨桔汁用超纯水配成的10%～80%样品中可溶性固形物、钾、总磷、氨基酸态氮、L-脯氨酸、总D-异柠檬酸和总黄酮7 项指标，并依据后6 种组分的标准值和权值综合计算桔汁添加量，同时用二极管阵列检测器液相色谱法检测了上述样品的桔汁含量，并与国标法检测结果进行对比。最终确定以橙皮苷作为快速检测的基准物，相对误差控制在1%范围内，空白加标回收率在98%～103%之间，相对标准偏差在1%～3%之间，相对误差在1%～5%之间(表3)。国标法在相对误差3%～8%之间(表4)。