咬合力影响大鼠下颌骨微结构发育的时序观察

邹昭琪 许彤彤 何川 丰懿恬 牛林 邹蕊

牙槽骨是人体骨骼最活跃的部分，具有高度可塑性，其生长代谢受到牙生长发育、脱落替换、雌激素水平[1-2]及咬合压力的影响。咬合压力由上下颌牙咬合时咀嚼肌群的肌力产生。研究发现[3-7]咬合力改变可引起牙槽骨形态以及微结构变化，但在既往研究[8-14]中，干预咬合力的手段及时间并不统一，研究者通常选择较长的干预时间，且不同研究组选择的时间变化跨度较大，无法确定某一干预手段下咬合力改变引起牙槽骨发生变化的始末。Micro-CT是微米级高效、无损检测设备，可清晰再现牙槽骨的内部及外部结构，精确地对其进行定量分析，目前广泛用于牙槽骨微结构观察[15-17]，下颌第一磨牙的牙槽间隔作为明显的咬合力集中区常作为骨小梁形态学测定的感兴趣区域[18]。本实验拟通过饮食法[11]干预雄性大鼠咬合力后，在不同时间点利用Micro-CT对其牙槽骨微结构发育进行时序性观察，验证咬合力改变对牙槽骨微结构发育的影响，并探究其产生影响的时间节点。从而为对牙槽骨微结构改变的进一步深入研究提供可靠的造模方法以及干预时间的选择依据，节省实验时间，提高研究效率。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用23 d龄的雄性SD大鼠63 只， SPF级，由西安交通大学实验动物中心提供。

1.2 主要实验设备及试剂

Micro-CT(Y.XLON公司，型号Y.Cheetah，德国); 软件VG studio Max3.0(Volume Graphics公司，德国); 戊巴比妥、 4%多聚甲醛(西安国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 选用23 d龄刚离乳，未行任何咀嚼运动的雄性SD大鼠63只，随机分为基线(Baseline)组7只、软食(SD)组28 只和硬食(HD)组28只。硬食组统一喂养标准鼠饲料，软食组统一喂养由与硬食组同种等重量鼠饲料磨成的粉末与饮用水的混合物(2∶1)。各组动物饮水自由，饲养条件严格一致，定期记录体重。基线组大鼠于当日处死。SD组和HD组大鼠分别在实验开始后第2 周、 第4 周、 第6 周、 第8 周各处死7 只。

1.3.2 Micro-CT扫描组标本制备 按照上述各组的节点，给相应的大鼠腹腔注射过量戊巴比妥，采用4%多聚甲醛灌注左心室的方式先行内固定后，分离取出大鼠下颌骨并置于4%多聚甲醛中行后固定， 4 ℃保存24 h。后将样本置于固定期内，进行扫描，扫描参数：电压90 kV，电流30 μA，投影数720，曝光时间600 ms，分辨率5 μm，使用专业软件VG studio Max3.0进行三维重建。

1.3.3 观察指标 Micro-CT扫描获得各组样本的图像后，进行三维重建，在大鼠下颌第一磨牙牙槽间隔区近根分叉的松质骨选择半径为400 μm、高度1 mm的圆柱体设定为感兴趣区域(Region of interest, ROI)(图 1～2)，上界为第一磨牙的根分叉，做定量分析，测量指标包括：骨体积/总体积(BV/TV,%)，骨表面积/总体积(BS/BV,1/mm)，平均骨小梁厚度(Tb.Th, mm)，平均骨小梁数量(TbN,1/mm)，平均骨小梁间距(Tb.Sp,mm)。

1.4 统计学分析

图 1 下颌骨ROI矢状面Fig 1 ROI on the sagittal plane of the mandible

图 2 ROI三维重建图像Fig 2 3D reconstruction image of ROI

使用SPSS 18.0软件进行统计学分析， 首先对各组数据进行正态性检验。组间数据比较采用独立样本t检验； 若P<0.05， 则表示差异具有统计学意义。

2 结 果

实验中SD组及HD组的大鼠体重变化仅与年龄相关，同一时间节点下，SD组与HD组的大鼠体重差异无统计学意义。

2.1 Micro-CT扫描参数分析结果

23 d龄的大鼠下颌第一磨牙Micro-CT矢状面影像显示，随着日龄增加，第一磨牙的牙根逐渐增长，根尖孔从第6 周开始逐渐闭合，根分叉区牙槽间隔松质骨密度增加；与SD组相比，同一时间节点下的HD组根分叉区牙槽间隔松质骨骨量较多(图 3)。

2.1.1 SD组与HD组的样本ROI的骨体积分数(BV/TV)均随年龄的增长不断增加。 第2、 4、 6、 8 周， SD组的BV/TV分别为0.36±0.42、 0.43±0.19、 0.49±0.03、 0.52±0.02， 分别为HD组的78.26%、79.63%、73.13%、75.36%，差异均具有显著的统计学意义(P<0.01)(图 4A)。

2.1.2 SD组与HD组样本ROI的骨表面积体积比(BS/BV)均随着年龄增长整体呈下降趋势，第0～2 周下降速度最快，但第2～4 周2 组BS/BV均升高。 第2、 4、 6、 8 周， SD组的BS/BV分别为30.65±4.13、 34.64±0.82、 25.73±1.79、 24.76±2.29，分别为HD组的1.15、1.22、1.42、1.31倍，其中第2 周的差异无统计学意义，第4、 6、 8 周的差异具有显著的统计学意义(P<0.01)(图 4B)。

2.1.3 SD与HD组样本ROI平均骨小梁数量(TbN)在0～2 周呈下降趋势，在第2～4 周升高。 第2、 4、 6、 8 周， SD组的TbN(5.61±0.35、7.60±0.15、 6.40±0.47、 6.53±0.8)均低于HD组(6.07±0.43、 7.65±0.95、 6.95±0.91、 6.83±0.42)， 但差异无统计学意义(图 4C)。

A: Baseline组; B： 2 周SD组; C： 2 周HD组; D： 4 周SD组; E： 2 周HD组; F： 6 周SD组; G： 6 周HD组; H： 8 周SD组; I： 8 周HD组A： Baseline group; B： SD group at week 2; C： HD group at week 2; D： SD group at week 4; E： HD group at week 4; F： SD group at week 6; G： HD group at week 6; H： SD group at week 8; I： HD group at week 8

2.1.4 SD组与HD组样本ROI平均骨小梁厚度(Tb.Th)整体呈上升趋势，但在2～4 周下降。 第2、 4、 6、 8 周， SD组的Tb.Th分别为0.066±0.087、 0.058±0.001、 0.078±0.005、 0.084±0.004，分别为HD组的86.84%、82.86%、69.03%、82.35%，其中第2周差异无统计学意义，第4、 6、 8 周的差异有显著的统计学意义(P<0.01或P<0.05)(图 4D)。

2.1.5 SD组与HD组样本ROI的平均骨小梁间距(Tb.Sp)在第0～2 周增大，第2～4 周减小， 第4～6 周略有上升。第2、 4、 6、 8 周， SD组的Tb.Sp分别为0.115±0.01、0.079±0.003、0.082±0.006、0.078±0.0011，分别为HD组的1.26、1.27、1.28、1.08倍，其中第8周的差异无统计学意义，第2、 4、 6 周的差异有显著的统计学意义(P<0.01或P<0.05)(图 4E)。

综上所述，在第2、 4、 6、 8 周，与HD组相比，SD组的BV/TV、Tb.Th、TbN减小； BS/BV、Tb.Sp增大。其中TbN的差异在4 个时间节点均无统计学意义， BV/TV、 Tb.Th、BS/BV、Tb.Sp在多个时间节点有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

喂食后第0～2 周、 4～8 周，SD组与HD组的BV/TV、 Tb.Th、 Tb.Sp增大， BS/BV、 TbN减小；喂食后第2～4 周， BV/TV、 BS/BV、 TbN 增大， Tb.Th、 Tb.Sp减小。

3 讨 论

3.1 饮食法模型的可靠性

咬合力可通过牙齿传递至牙槽骨，为了观察咬合力对牙槽骨的影响，国外学者建立了几种模拟不同咬合力状态的动物模型， ① 磨牙法[8]、 ② 拔牙法[9-10]、 ③ 饮食法[11]、 ④ 固定桥修复法[12]、 ⑤ 肌肉切除法[13]。其中饮食法是将部分大鼠喂以硬食，使咀嚼肌的功能增强，产生的咬合力增大，将部分大鼠喂以软食，使咀嚼肌的功能减弱，产生的咬合力降低； 该方法无创伤且简单易行，因此本实验采用饮食法[11]模型观察咬合力对刚离乳大鼠牙槽骨微结构发育的影响。结果表明，刚离乳的23 d龄的大鼠在喂养后第2、 4、 6、 8 周，相比HD组大鼠，SD组大鼠的第一磨牙牙槽间隔近根分叉处的松质骨骨量下降，骨小梁变细、变稀疏，骨髓腔变大。说明咀嚼肌产生的咬合力是影响牙槽骨微结构发育的重要因素，证实了饮食法模型的可靠性。

图 4 Micro-CT扫描参数分析Fig 4 Analysis of the data of Micro-CT scanning

3.2 牙槽骨微结构发育的时序变化

在咬合力影响牙槽骨发育的研究中，Tanaka等[19]将雄性3 周龄的Wistar大鼠分软、硬食组观察9 周，通过Micro-CT观察发现软食组下颌骨髁突松质骨的矿化程度较硬食组明显更低。此后，Bresin等[20]将年轻大鼠分软、硬食两组喂养4周发现，软食组第一磨牙牙槽间隔的松质骨骨密度减小、下颌骨骨量减小。近些年，Hichijo等[21]用 10 只 21 d龄的雄性Wistar大鼠，分软、硬食两组喂养11 周，发现软食组在髁突和咬肌附着处的骨体积分数(BV/TV)显著低于硬食组。Shimizu等[22]将3周龄雄性Wistar大鼠分软、硬食两组喂养9 周，用Micro-CT检测发现软食组下颌第一磨牙牙槽间隔的BV/TV、Tb.Th、TbN显著减小，与本研究结果一致。

以上研究都仅描述了某一时间节点咬合力对牙槽骨形态或结构的影响，而关于牙槽骨的连续性变化的研究目前相对较少。因此本研究选取0、 2、 4、 6、 8 周作为对咬合力影响牙槽骨微结构发育观察的时间点，发现其影响在软食组和硬食组具有一致性：①在喂食后0～8周，牙槽骨微结构的发育表现为随着大鼠日龄的增加，ROI内BV/TV逐渐增大，表明这个时段大鼠第一磨牙牙槽间隔近根分叉处的松质骨骨量增多；② 在喂食后0～2 周、 4～8 周，ROI区域内Tb.Th、Tb.Sp增大说明样本骨小梁变粗，变稀疏，骨髓腔变大。表明这个时段大鼠第一磨牙牙槽间隔近根分叉处的松质骨生长以整体的膨胀性生长为主；③ 值得注意的是，在喂食后第2～4 周，ROI内BS/BV增大，说明骨量增加但骨表面积增量更大；Tb.Sp减小说明骨小梁变密集，骨髓腔变小。此外，ROI内Tb.Th减小、TbN 增大，导致这一变化的原因可能是新生骨小梁增多，以上结果表明这一时期的大鼠第一磨牙牙槽间隔近根分叉处的松质骨生长以骨小梁的生长为主。④在喂食后第8周，样本ROI的TbN、Tb.Th、Tb.Sp趋于一致，可能由于8 周后骨小梁的生长逐渐完成，有待研究证实。在通过以上对牙槽骨微结构发育的时序变化特点的进一步了解，可帮助后续的相关研究选择更具有针对性的时间节点。

4 结 论