基质金属蛋白酶在中耳胆脂瘤中的表达

2019-03-04李文文宋少鹏马秀岚

中华耳科学杂志 2019年1期

李文文宋少鹏马秀岚

中国医科大学附属盛京医院耳科

中耳胆脂瘤是一种良性鳞状上皮角质化增生性病变[1]，由鳞状层状角质化上皮细胞组成，它表现为一种含有成纤维细胞和炎性细胞的表皮样囊肿[2]。中耳胆脂瘤的特点是细胞过度增殖[3,4],伴随的是角蛋白碎片的积累和颞骨及其周围骨结构的破坏[5]。胆脂瘤除导致听力损伤和耳流脓外还可以导致多种颅内外并发症，如迷路炎、面瘫、乙状窦血栓性静脉炎、脑膜炎、脑脓肿等[6,7]。胆脂瘤发病机制复杂，影响因素很多[7]，对中耳胆脂瘤患者体内基质金属蛋白酶基因表达量及蛋白表达情况的研究，有助于提高对胆脂瘤复杂的致病机制的认识。本文选用WB和PCR完善MMP在中耳胆脂瘤发生发展过程中的机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2017年2月～2018年2月在盛京医院耳科手术的部分中耳胆脂瘤标本36例,同时收集术耳外耳道皮肤29例（开放式乳突切除术+鼓室成形术+耳甲腔成型术中废弃不用的外耳道皮肤的小碎块）作为对照组。其中男16例，女20例，年龄18-64岁，平均年龄41.85岁病程为一月至40年不等。留取样本组织置于液氮中或者放入深低温(-80℃)冰箱中保存备用。

1.2 主要试剂及来源

鼠抗人MMP2抗体购于R&D，兔抗人MMP9抗体购于CST（CELL Singaling TECHNOLOGY），鼠抗人GAPDH抗体购于proteintech，RT-PCR试剂购于TAKARA，引物由生工生物工程公司合成，见表1。

1.3 RT-PCR检测MMP2和MMP9mRNA的表达情况

1.3.1 总RNA的抽提和反转录

50mg组织，加800ulRNAiso Plus后匀浆，静置5min，加入 200ul氯仿，震荡均匀，静置 5min，12000g 4℃离心15min，上清移入新EP管，加入500ul异丙醇，静置10min，12000g 4℃离心10min，弃上清，加入500ul75%乙醇清洗沉淀，7500g 4℃离心5min，弃上清保留沉淀，干燥，溶解于适量DEPC水中，用于反转录的模板。cDNA合成按照Prime⁃ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明完成。

1.3.2 RT-PCR

反应体系 SYBR Premix Ex TaqⅡ 10ul,PCR Forward Primer(5uM)1ul,PCR Reverse Primer(5uM)1ul,DNA模板 2ul，DEPC水6ul，共20ul。PCR反应条件预变性95℃ 30s；PCR反应，95℃ 5s，60℃ 20s，40个循环结束。

1.3.3 PCR产物的鉴定琼脂糖凝胶电泳用0.5X TBE配制1.5%琼脂糖凝胶，电泳缓冲液为0.5X TBE，电压100v，电泳1h。用溴化乙锭显色。

1.4 Western Blot检测MMP2和MMP9的蛋白表达情况

取适量组织，加入RIPA裂解液，冰上充分研磨，充分震荡，静止10min重复三次，4度12000g离心30min，提取上清液，保存备用。检测蛋白浓度，配胶，上样，电泳，恒压80v跑电泳，按照marker的指示，根据每个蛋白分子量的不同，切出所需蛋白分子量的胶：MMP2约为72KD,MMP9约为84-92KD,GAPDH约为36KD。PVDF膜进行转膜，转膜后用5%的脱脂牛奶封闭2h，后用2.5%牛奶按照一定的比例稀释一抗：MMP2 1:500,MMP9 1:1000,GAPDH 1:5000。一抗4℃冷放孵育过夜，1xT⁃BST洗涤三次，每次10min，二抗室温孵育两小时，1xTBST洗涤三次，每次10min。利用电化学发光ECL显色试剂盒显色，软件分析条带吸光度。

1.4 统计学方法

采用SPSS32.0软件进行统计学分析。对数据进行t检验，正态分布检验，方差齐性检验，计量资料以均数±标准差表示，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP2和MMP9在中耳胆脂瘤及外耳道皮肤的蛋白的表达

中耳胆脂瘤中MMP2和MMP9的表达量明显高于外耳道皮肤，对样本相对灰度值分析结果显示，中耳胆脂瘤中MMP2的相对表达量4.110±1.039，高于外耳道皮肤0.6660±0.2151（P<0.05）,胆脂瘤中MMP9的相对表达量15.98±6.520显著高于外耳道皮肤1.033±0.3756（P<0.05）具有统计学意义。见图1和表2。

图1 MMP2和MMP9在中耳胆脂瘤与外耳道皮肤中蛋白的表达情况（C:胆脂瘤，N：外耳道皮肤）Fig.1 Expression of proteins(MMP2 and MMP9)in middle ear cholesteatoma and external auditory canal skin（C:cholesteatoma,N:normal skin）

2.2 MMP2和MMP9在中耳胆脂瘤及外耳道皮肤中的mRNA的表达情况

MMP2，MMP9在中耳胆脂瘤及外耳道皮肤中均表达，MMP2和MMP9在中耳胆脂瘤中的表达明显高与外耳道皮肤，用2-ΔΔCT计算，胆脂瘤组和对照组的MMP2 mRNA相对表达量分别为8.234±2.325和1.255±0.3087，差异有统计学意义（P<0.01）。胆脂瘤组和对照组的MMP9 mRNA相对表达量分别为99.35±31.92和1.522±0.5290，差异有统计学意义（P<0.01），见图2和表3。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

图2 MMP2和MMP9在中耳胆脂瘤与外耳道皮肤中mRNA的表达情况(C:胆脂瘤，N：外耳道皮肤)Fig.2 mRNA expression of MMP2 and MMP9 in middle ear cholesteatoma and the skin of external auditory canal(C:cholesteatoma,N:normal skin)

3 讨论

中耳胆脂瘤是一种具有侵袭性的发生于颞骨区的角质化鳞状上皮异常生长，胆脂瘤上皮细胞可分泌炎症因子[8]，而这些炎症因子使胆脂瘤发展程度加重[9]。胆脂瘤角化细胞具有与肿瘤相似的增殖和迁移特征[10]，在胆脂瘤上皮增殖的过程中，不仅可以了解到该病的发病机制，更能预测胆脂瘤可能的发展方向。众多研究人员证实胆脂瘤标本中肿瘤相关基因和增殖标志物上调[11,12]。MMP是一组由内皮细胞、星形胶质细胞等分泌的锌依赖性蛋白酶[13]，MMP9和MMP2是其非常重要的两个亚型，在正常生理情况下MMPS表达水平极低，而在炎症因子、生长因子、高糖和氧化应激的情况等环境及病理条件下MMPS的表达显著上调。活化的基质金属蛋白酶MMPS可以通过水解基底膜（BM）和细胞外基质(ECM)，影响角质上皮细胞的增殖、迁移和分化过程[14,15]。多项研究表明，在上皮源性肿瘤组织中，如肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌及前列腺癌等恶性肿瘤等，均发现MMPS的高表达与肿瘤的转移和预后不良密切相关[16]。Olszewska发现MMP可以降低某些激素、生长因子、细胞因子和趋化因子[17]。Duellman发现SNP（单核多态性）能通过miRNA靶向基因的编码区域特异性调控MMP9,使我们更全面的了解MMP多因素的作用[18]。本实验中RT-PCR有助于分析MMP2和MMP9基因的表达，并建立分子活性与听力损伤的相关性。一旦这种相关性得到证实，就有可能提出对中耳胆脂瘤的防控策略。尽管核酸分析技术发展迅速，但在特定文献中仅有极少论文使用RT-PCR来研究MMPs的基因表达及其抑制剂，可能是由于从胆脂瘤标本中提取RNA的技术困难。采用本实验技术的方法提取胆脂瘤的RNA[19]，提取出的RNA的OD比值在1.8~2.0之间，浓度在500~2000ng/ul。RT-PCR结果显示，在中耳胆脂瘤中MMP2,MMP9的mRNA的表达量是上调的，差异具有统计学意义。由于胆脂瘤体积限制，在本实验中采取了改良的提取蛋白的方法[20]，使用提取完RNA的蛋白层，加入乙醇、异丙醇、盐酸胍、SDS按照相应的时间和离心条件提取蛋白，western blot条带进行Gel-Pro Analyzer灰度值分析，结果显示MMP2,MMP9在中耳胆脂瘤中的蛋白表达明显高于外耳道正常皮肤，其差异具有统计学意义。

目前胆脂瘤尚无药物治疗，标准治疗方法是手术切除[21]，MMPs过表达与多种致瘤事件(包括早期癌变、肿瘤生长、肿瘤侵袭、血管生成和转移)之间的强因果关系使其成为具有吸引力的治疗靶点。因此，一些广泛的抑制剂(MMPI)进入晚期癌症患者的III期临床试验[22]。MMP9单克隆抗体GS-5745可使约45%的重度溃疡性结肠炎患者获益，结肠炎症得到控制[23]；氯霉素可选择性抑制MMP2,胶质细胞瘤高表达MMP2,因此其可能用于胶质细胞瘤的治疗[24]。MMPS表达水平调控包括基因水平和酶原活化，因此，开发同时具有抑制MMPS基因表达和抑制MMPS酶活性的靶向药物可能成为新的MMPS研究方向，如联合纳米探针-MMPS的生物工程新方案可实现对部分肿瘤组织MMPS的特异性抑制[25]。