听神经病患者OTOF基因突变的遗传特征及其相关功能机制研究进展

高欣 张秋静 王大勇 王秋菊

解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科解放军耳鼻咽喉研究所（北京100853）

听神经病（auditory neuropathy,AN），又称听神经病谱系障碍（auditory neuropathy spectrum disor⁃der,ANSD），是一种外毛细胞功能正常，而内毛细胞和听神经突触和/或听神经本身功能不良导致的听功能障碍性疾病[1]。其典型临床表现是言语理解力受损，而言语察觉阈和纯音听阈可以正常，也可以严重受损；听力学检查特点是耳声发射和/或耳蜗微音电位可正常引出，而听性脑干反应无明显分化的波形或严重异常[1-3]。

AN患者临床表现多样，可单独发病，也可伴发其他周围神经病变[4]；通常我们将听神经病分为非综合征型听神经病和综合征型听神经病，目前已知的导致非综合征型听神经病的基因有常染色体隐形遗传的DFNA9（OTOF）基因和DFNA59（PJVK）基因、常染色体显性遗传的AUNA1（DI⁃APH3）基因和半X连锁遗传的AUNX1基因，除此之外，GJB2的某些突变也可导致听神经病[1-2]。本文着重介绍由OTOF基因导致的非综合征型听神经病。

1 OTOF基因—转录、翻译、基因变异

图1 OTOF基因转录翻译的otoferlin蛋白的结构图。黑色区域代表C2结构域，共6个，分别称为C2A、C2B、C2C、C2D、C2E和C2FFig.1 Strucrure of otoferlin translated by OTOF gene.Black regions represent six C2 domains(C2A、C2B、C2C、C2D、C2E、C2F)

OTOF基因也被称为DFNA9基因，位于人染色体2p23.1，最早在一个患有遗传性耳聋的黎巴嫩近亲家系中[3]被发现，基因全长101496bp，含有48个外显子，编码翻译含有1997个氨基酸的otoferlin蛋白，蛋白结构包含6个钙离子结合C2结构域（如图1），参与到内毛细胞突触囊泡膜融合释放神经递质过程中。OTOF基因在耳蜗、前庭和大脑组织中表达，共有5个转录本，人类大脑中检测到2种OTOF转录本的表达，这2种转录本或终止于47号外显子或终止于48号外显子；但是在人类耳蜗中只有一种终止于48号外显子的OTOF转录本存在。

OTOF基因变异可引起先天性语前重度遗传性耳聋[4]，遗传方式为常染色体隐形遗传。大部分OTOF变异点是散发和独有的，每一个变异点都只在一个家系中被报道，截止至2018年12月OTOF基因已有190多个变异点被报道。不同人群中OTOF基因变异点也不尽相同，OTOF基因的p.Q829X（c.2485C>T）变异在西班牙人群中较为常见，同时在法国、阿根廷、墨西哥和英国人群中也有较高的发病率[4-5]。p.R1939Q（c.5816G>A）是日本人群较为常见的致病ANSD的变异点之一。而在中国台湾人群中，OTOF基因的p.E1700Q变异率高达23%[6]。ANSD的既往研究也发现OTOF基因在不同国家的突变率是不一样的，如西班牙86.7%（13/15）；巴西63.6%（7/11）；日本56.5%（13/23）；美国55.6%（5/9）；中国台湾22.7%（5/22）；韩国5.2%（1/19），也有相关研究发现韩国人群OTOF突变率高达85.7%（6/7）[7]。中国人群中认为OTOF基因是导致婴幼儿听神经病的主要致病基因，王秋菊教授团队发现婴幼儿听神经病中OTOF基因的发病率为41.2%（14/34），远远高于成人听神经病中的发病率5.5%（4/73）[8]。

2 otoferlin蛋白功能—与内毛细胞带状突触神经元传递有关

2006年Roux等发表Cell文章构建了OTOF基因敲除小鼠模型，研究发现OTOF基因的敲除导致突触的胞吐功能几乎完全被废除，从而揭开了OTOF基因可能参与神经元传递的重要功能[9]。

参与神经元传递的蛋白有相似的结构特征，大部分都含有一个C2结构域，而能够介导Ca2+触发的胞吐过程的蛋白则有多个C2结构域，同时还至少有一个跨膜结构区。德克萨斯大学医学分校的Ok-Ho Shin教授将这类蛋白分为4大类：1）突触结合蛋白（Syt类蛋白）；2）扩展的突触结合蛋白（E-Syt类蛋白）；3）ferlin家族蛋白；4）有多个C2结构域和跨膜结构域的蛋白[10]。

在这几类蛋白中OTOF转录翻译的otoferlin蛋白，属于Ferlin家族蛋白，是在细胞膜上锚定的胞浆蛋白。otoferlin蛋白有6个C2结构域，分别是C2A、C2B、C2C、C2D、C2E和C2F结构域，表达于突触囊泡上，参与介导Ca2+触发的突触囊泡胞吐过程。这6个结构域均可和突触前SNARE蛋白（陷阱分子：内毛细胞带状突触神经递质释放异常，其内毛细胞与传入神经元所形成的带型突触形态保持正常，钙离子流通也正常，但是突触囊泡的胞吐作用却完全废止，被称为陷阱分子（SNARE molecules），如Synt1，SNAP25，Syb2）发生相互作用，除了C2A结构域，其他5个C2结构域均可和酸性脂质体中的钙离子结合。otoferlin作为一种钙离子感应器，在内毛细胞带型突触处触发膜融合，从而在内毛细胞突触囊泡的胞吐过程中发挥着重要作用。除此之外，otoferlin蛋白还能参与RRP的补充再循环，在将囊泡招募到活动带细胞膜上发挥重要作用。

既往研究认为内毛细胞带状突触与传统突触神经递质传递机制明显不同，且在内毛细胞中，传统通路中的核心分子Syt1和Syt2蛋白并不表达，而参与释放神经递质过程的otoferlin蛋白等也是内毛细胞所特有的，而且过程中的其他辅助参与蛋白也与传统突触传递不相关，目前机制尚不明确。

3 小鼠模型

基因的功能研究离不开合适的模式动物，近年来OTOF基因的研究也有多种小鼠模型。

3.1 Otof-/-小鼠

2006年，法国巴斯德研究所Petit教授发表Cell文章，首次对OTOF基因的功能进行了探索。他们构建了完全敲除OTOF基因的Otof-/-小鼠模型，该小鼠听力学表型表现为极重度耳聋。通过该小鼠模型，Petit教授发现OTOF基因编码的otoferlin蛋白在耳蜗内毛细胞基底外侧部表达，是组成内毛细胞突触前结构的重要部分，且OTOF基因的完全敲除没有影响内毛细胞与神经元所形成的带型突触形态，其钙离子流通也正常，但是突触囊泡的胞吐作用却完全废止，因此后来也将OTOF基因称为陷阱分子(SNARE molecules)。对Otof-/-小鼠模型的研究首次揭露了OTOF基因可能在突触囊泡释放神经递质的过程中发挥重要作用。otoferlin蛋白作为一种钙离子感应器，在内毛细胞带型突触处触发膜融合，从而在内毛细胞突触囊泡的胞吐过程中发挥着重要作用。

3.2 Otofdeaf5Jcs小鼠

2005年Wilson等人实验失败而偶然构建出了隐形遗传的由ENU(N-ethyl-N-nitrosourea乙酰基亚硝基脲)药物诱导致鼠5号染色体上一个随机突变而致极重度耳聋的deaf5小鼠[11]，该突变位置范围在5号染色体Shh基因(position 28.8 Mb,NCBI build 36)和D5Mit229基因 (position 31.9 Mb)之间。这段约3.1 Mb DNA片段中包含OTOF基因(posi⁃tion 30.7 Mb)。

直到2007年Chantal Longo-Guess等人在Hear⁃ing Research杂志上发表文章[12]，认为上述老鼠模型的极重度聋表型是由于OTOF基因突变导致，命名为Otofdeaf5Jcs小鼠。作者对该小鼠模型进行基因测序，发现OTOF基因的10号外显子上953核苷酸由T突变成A，导致C2B结构域中的对应318位置的氨基酸由异亮氨酸突变为天冬氨酸。

3.3 OtofPga/Pga小鼠

2007年Martin Schwander等人用ENU药物作用于老鼠，随机诱变出19个耳聋表型的小鼠系，其中之一为OTOF基因突变致聋，称为Pachanga老鼠系或OtofPga/Pga小鼠。OtofPga/Pga小鼠测序结果为

OTOF基因C2F结构域的一个错义突变导致相应位置的天冬氨酸突变为甘氨酸(p.D1767G)，小鼠的听力学分析发现其ABR阈值超过90dBnHL，DPOAE正常，毛细胞纤维束有轻微的结构紊乱。由于该文中构建了多达19个鼠系且重点进行了PJVK基因突变相关鼠系的研究，因此对Pachanga鼠系文中未做过多阐述。该文章发表在2007年的The Journal of Neuroscience杂志上[13]。

3.4 OtofI515T/I515T小鼠

2016年ENMO杂志上Nicola Strenzke等研究人员发表文章，构建了OtofI515T/I515T老鼠模型，OTOF基因p.I515T突变的患者表现为温度敏感性听神经病，该点突变的老鼠模型听力损失程度与温度敏感性听神经病患者相似。对该老鼠模型的研究发现OTOF基因的c.1544T>C（p.Ile515Thr）突变导致内毛细胞内otoferlin蛋白水平下调65%，突触囊泡体积变大，同时研究还发现otoferlin蛋白在胞膜上的数量与囊泡的分泌和听力通路的传导密切相关。文章鉴定到了otofelin蛋白上的一段约20个氨基酸长度的结构域，该结构域包含一个RXR结构域，当OTOF发生p.Ile515Thr突变时，该结构域会降低otofelin蛋白在胞膜上的数量，从而导致听力损失[14,15]。

3.5 OtofC2C/C2C小鼠（OtofAla515,Ala517/Ala515,Ala517小鼠）

Petit教授团队2017年在eLIFE杂志上发表了新的关于OTOF基因的新文章。文中构建了OtofC2C/C2C小鼠模型，将otoferlin蛋白的515和517位的天冬氨基酸突变为甘氨酸，使这两点所在的C2C结构域与Ca2+的亲和力降低，但是内毛细胞带状突触的结构、Ca2+浓度和otoferlin蛋白的分布均不受影响，对该突变小鼠测听发现ABR阈值和野生型小鼠相差不大，但是ABR的I波振幅降低。进一步实验发现OtofC2C/C2C小鼠内毛细胞对Ca2+释放触发的突触囊泡释放延迟和速度减慢，同时影响了Ca2+依赖的泡池补给，揭示了otoferlin蛋白是突触囊泡融合和泡池补给的感应器。

截止到目前小鼠模型内没有挽救rescue实验被报道。2018年12月3日Moser教授团队在EM⁃BO Molecular Medicine杂志上发表文章构建出双重-AAV病毒载体质粒[16]，能够将otoferlin蛋白高效转入内毛细胞中，效率达50%，此技术的发现对于OTOF基因功能的研究将有更长足的研究进展。

4 斑马鱼模型

除了OTOF相关变异的小鼠模型，也有相关文章在模式动物斑马鱼上构建了敲低OTOF基因的斑马鱼模型。

不同于哺乳类动物，斑马鱼体内的otoferlin蛋白有两种，基因分别定位于斑马鱼的17号和20号染色体。17号染色体上的OTOF基因转录翻译后称为otoferlin b，20号染色体的OTOF基因转录翻译的称为otoferlin a。研究发现不同种族之间的otoferlin蛋白是高度保守的，斑马鱼体内的otoferlin蛋白和人类otoferlin蛋白相比相似度高达74%（otoferlin b）和76%（otoferlin a），而在C2结构域两者有更高的相似度，77%（C2A）91%（C2B）89%（C2C）83%（C2D）88%（C2E）94%（C2F）。相较于otoferlin a有全部6个C2结构域，otoferlin b没有C2A结构域，因此otoferlin a与人类otoferlin蛋白更相似。

来自俄勒冈州立大学的Paroma Chatterjee等人用morpholino药物诱导的方法构建了敲低OTOF基因的斑马鱼模型，并且利用该模型进行了全长或截短的otoferlin蛋白挽救rescue实验，而在之前多类小鼠模型中均没有进行相应的挽救rescue实验。实验发现otoferlin蛋白在斑马鱼发育早期开始表达，蛋白定位于斑马鱼的毛细胞和中脑，免疫荧光实验显示otoferlin蛋白在毛细胞的顶带和基底外侧区域分布。otoferlin蛋白的敲低导致斑马鱼的听觉、平衡觉和位置感知能力的缺陷，且otoferlin突变斑马鱼的鱼鳔发育不良。作者用老鼠otoferlin蛋白进行了挽救rescue实验，成功恢复了斑马鱼的听觉、平衡觉及鱼鳔的发育，并且发现保留C末端的C2F结构域能够成功挽救表型，然而保留N末端的C2A结构域却没有挽救表型，这可能是由于C2A结构域不能和Ca2+结合进而不能发挥正常功能有关。

目前斑马鱼尚没有被广泛认可的稳定的听觉功能评价体系，但有建模时间快、发育时程短容易观察的优点，可能在将来会成为研究听觉通路的重要模式动物。

5 与otoferlin蛋白发生相互作用的蛋白

为发挥正常功能，otoferlin蛋白可以与一些蛋白发生相互作用（如图2）。这些蛋白或与otoferlin蛋白一起发挥正常功能，或参与otoferlin蛋白的定位，是otoferlin蛋白发挥正常功能过程中不可或缺的，如Rab8b蛋白和otoferlin蛋白共同参与再循环内体和囊泡运输过程，以TRC40蛋白为核心的信号通路参与介导otoferlin蛋白的细胞膜锚定过程。

图2 可与otoferlin蛋白发生相互作用的蛋白分类Fig.2 The classification of protein which can interact with otoferlin

6 OTOF突变患者的听力学分析

大部分携带两个OTOF突变的患者表现为重度至极重度的听力损失和ABR缺失，Rosamaria Santarelli等曾对8个由OTOF变异导致的听力下降的患儿进行了听力学分析，相关文章发表在2015年的Hearing Researh杂志上[17]。

研究发现患儿纯音听阈均为重度听力损失，仅在个别低频频率尚有残存听力，双耳ABR均未引出波形，DPOAE则均正常引出，这与听神经病患者的听力学特征是相符的。因患儿年龄尚小不能配合，文中未能进行患者的言语识别率检查。

作者发现OTOF突变患者的耳蜗电图波形呈现出不同的特点，根据波形性状将耳蜗电图分为3种模式，分别称为A、B、C模式。A模式特点是仅记录到延长响应的波形，没有记录到CAP；B模式特点是在高刺激水平叠加下观察到与正常人的CAP相比，OTOF突变患者CAP的波峰小；C模式是记录到与正常人相同峰值、潜伏期的SP波，而在开始后约2-3ms，CAP被记录到。

此类患者该如何干预和治疗？耳蜗植入手术是否可行？目前有11篇相关文献对OTOF突变听神经病患者进行了人工耳蜗植入效果进行了探讨，此类患者实行人工耳蜗植入仅有33例，其中高加索人2例、法国3例、意大利9例、韩国5例、中国大陆和中国台湾共14例，效果尚可，在临床中是否从ANSD患者中将OTOF突变患者分离出来，OTOF基因变异能否成为衡量人工耳蜗植入手术的指标尚待更全面的分析和随访。除了人工耳蜗植入，听神经病患者还可进行内科治疗，用以糖皮质激素为主辅以营养神经和改善微循环药物的方案，能够实现提高听神经病患者的纯音听阈和言语识别率[18]。

7 OTOF基因与温度敏感性听神经病

早在1998年，Starr教授发现患有听神经病的一对双胞胎患儿，当两人高烧时听力损失加重。2016年王秋菊教授团队又发现了4例类似表现的听神经病患儿[19]，他们体温的升高都导致了听力的进一步下降。这类患者的特征是无发热时表现为相对正常的听觉，但一旦体温升高，就会出现严重的听力损失，CAP和ABR均消失，且这些患者都是OTOF基因的纯合变异或复合杂合变异基因型，这些变异导致只发生在患者体温升高后的听力损失，伴随体温的恢复正常听力也随之恢复，这类疾病被称为温度敏感性听神经病（temperature-dependent auditory neuropathy，TSAN）。

温度敏感性听神经病的内在机制是什么？2016年Strenzke等人在ENMO杂志上发表文章初步揭示了听力损失和高热之间的病理机制。Nico⁃la Strenzke等研究人员构建了OtofI515T/I515T的老鼠模型，该老鼠模型的听力损失程度与温度敏感性听神经病患者相似。文章构建了带有OTOF基因的p.Ile515Thr点突变老鼠模型，该突变导致了OTOF基因的表达量下调。老鼠表型为ABR缺失、轻度听力损失，DPOAE则能完整引出，听力损失程度与温度敏感性听神经病患者类似。研究发现内毛细胞功能和声音合成与otoferlin在胞膜上的数量相关，当细胞膜上的otoferlin蛋白量下降时，突触介导的声音合成过程异常，进而导致听力损失。OTOF基因的c.1544T>C（p.Ile 515 Thr）突变导致内毛细胞内otoferlin蛋白水平下调65%，突触囊泡体积变大，当体温升高后，内毛细胞膜上的otoferlin蛋白降低，囊泡分泌减少，神经递质不能正常传导，从而导致极重度耳聋。尽管该老鼠模型模拟了和人类OTOF变异一致的基因型，但是该老鼠模型在高温下并没有像人类一样出现更重的听力下降，研究发现和人类相比，老鼠的otoferlin蛋白有一个富含精氨酸的共20个氨基酸多肽称为RXR组块，可能是该结构导致高温下的表型不一致。