右美托咪定通过降低IL-17和RORγt的表达降低脓毒症小鼠的肺损伤*

，，

(1. 广西医科大学附属肿瘤医院，广西 南宁 530021；2. 广西医科大学研究生院，广西 南宁 530021)

脓毒症是由感染引发，导致炎症介质的强烈释放的全身炎症反应综合征。尽管自希波克拉底时期(公元前470年)以来，脓毒症一直存在，但对于在儿科和成人重症监护室工作的医生，脓毒症依然是一个严重的科学问题，危害着全世界的健康问题[1]。它不仅死亡率高，而且住院费更是让普通家庭承担不起，保守估计，脓毒症占2011年美国医院总住院费的200多亿元[2]。右美托咪定可发挥镇痛、镇静、抗焦虑作用，抑制交感神经活动，维持血流动力学平稳，减少麻醉剂的用量[3]，所以在临床上得到广泛使用。近年来，众多研究发现右美托咪定还具有抗炎作用，不仅能降低肾损伤，还可以降低肺损伤[4]，对呼吸机相关性肺损伤具有保护作用[5]。本研究旨在探讨右美托咪定对盲肠结扎穿孔致脓毒症小鼠的肺保护作用，为右美托咪定在治疗脓毒症中提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 SPF级雄性C57BL/6小鼠32只，6～8周龄，体重20～25 g。购于长沙市天勤生物科技有限公司(动物合格证编号：SYXK(湘)2014-0011)。IL-17小鼠ELISA试剂盒(武汉华美,货号：CSB-E04608m)； SDS蛋白上样缓冲液5×(碧云天，货号：P0015)、1 M Tris-HCl，pH 6.8(索莱宝，货号：T1020)，1.5 M Tris-HCl，pH 8.8(索莱宝，货号：T1010)、30%Acr-Bis(索莱宝，货号A010))、甲醇(科龙，货号：A454-4)、20XTBS(上海生工，货号：B548105)、RORγt单克隆抗体(Abcam公司，货号ab60134)。

1.2 分组及模型制备 32只C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为4组(n=8)：假手术组(S组)、右美托咪定组(Dex组)、脓毒症组(Sep组)、脓毒症+右美托咪定组(Sep+Dex组)。小鼠术前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠后固定。S组于术前30 min腹腔注射等容量生理盐水，备皮剖腹后仅分离盲肠远端，关腹。DEX组于术前30 min腹腔注射右美托咪定(江苏恩华)40 μg/kg，备皮剖腹后仅分离盲肠远端，关腹。Sep组于术前30 min腹腔注射等容量生理盐水，经腹正中线开腹，开口长度1 cm，游离盲肠，采用4-0丝线结扎回盲瓣与盲肠末端，并用18G针头贯穿结扎端的盲肠，还纳肠管，关腹。Sep+Dex组于术前30 min腹腔注射右美托咪定(江苏恩华)40 μg/kg，其余步骤与Sep组一致。

1.3 标本采集 手术后24 h经眼球放血处死小鼠，收集血液，静置3 h离心(2000 r/min，15 min)取上清，置于-80℃冰箱保存备用。剪开胸腔取小鼠肺组织，取右肺上叶置于4%多聚甲醛中固定，左肺置于含PBS培养皿中，其余置于-80℃冰箱保存备用。

1.4 组织病理学观察 肺组织在多聚甲醛中固定24 h后，进行石蜡包埋、切片及HE染色。在光镜下根据肺泡间隔增厚和(或)透明膜形成、炎性细胞浸润、肺充血、肺出血四个方面进行肺损伤半定量分析，由两名专业的病理科医生从每个组织切片中取出5个显微镜视野评分，取均值。

1.5 肺湿重/干重(W/D)比值 左肺用滤纸轻轻拭干表面的水分，用天平测量所得为湿重，将左肺放入75℃烤箱中烘烤72 h，此刻用天平测量所得为干重，计算W/D比值。

1.6 IL-17蛋白检测 ELISA检测外周血、肺组织IL-17含量操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.7 RORγt蛋白含量检测 Western blot法检测肺组织RORγt蛋白含量将肺组织和磷酸酶抑制剂和RIPA混合，匀浆后在冰上温育15 min，离心后加入SDS蛋白上样缓冲液，煮沸变性。在SDS-PAGE上通过电泳分离等量的蛋白质，转膜。用5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜后将膜与一抗(Abcam，1∶500)在4℃下孵育过夜，洗膜后孵二抗(Abcam，1∶1000)并用Image Lab 5.1软件分析，目的蛋白条带灰度值比GAPDH条带灰度值为目的蛋白表达水平。

2 结果

2.1 光镜下小鼠肺组织学表现 S组和Dex组未见明显损伤，肺泡较为完整，炎性细胞、出血、充血较少，Dex组与S组差异无统计学意义(P=0.799)。Sep组肺泡壁损伤严重，几乎无完整的肺泡结构，炎性细胞广泛浸润，肺出血、充血明显(P<0.01)。见图1。

图1 光镜下观察各组小鼠肺组织病理学改变

2.2 四组小鼠肺损伤评分W/D结果比较 Sep+Dex组的肺损伤程度明显低于Sep组，但比S组和Dex组肺损伤程度要高(P<0.001)，见表1。

表1 四组小鼠肺组织指标的比较

注：与S组比较，a：P<0.05；与Dex组比较，b：P<0.05；与Sep组比较，c：P<0.05

2.3 四组小鼠血浆IL-17浓度、肺组织IL-17浓度、肺组织RORγt蛋白含量比较 与Sep组比较，Sep+Dex组IL-17浓度明显降低(P<0.05)，见表2。

2.4 小鼠肺组织RORγt蛋白含量与S组比较 Sep组肺组织RORγt蛋白含量明显增加(P<0.001)；与Sep组比较，Sep+Dex组RORγt蛋白含量明显下降(P=0.001)，见表2、图2。

表2 四组小鼠血浆IL-17浓度、肺组织IL-17浓度、肺组织RORγt蛋白含量

注：与S组比较，a：P<0.05；与Dex组比较，b：P<0.05；与Sep组比较，c：P<0.05

图2 蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)检测各组小鼠肺组织RORγt的蛋白表达

注：S组为假手术组，Dex组为假手术加右美托咪定组，Sep组为盲肠结扎穿孔组，Sep+Dex组为盲肠结扎穿孔加右美托咪定组；RORγt为维甲酸孤核受体，GAPDH为3-磷酸甘油脱氢酶

3 讨论

脓毒症是一种病理状态，是由有害的感染对宿主过度炎症反应引起的。脓毒症[6]以低血压、高灌注和器官功能障碍为特征，而多种炎性细胞因子的异常累计导致多器官衰竭、低血压、低灌注，最终死亡。有文献[7]指出，经过盲肠结扎的小鼠出现呼吸急促、四肢冰冷、口唇发绀、剖腹观察到部分盲肠呈黑色坏死状。本研究结果表明，Sep组和S组相比，肺损伤评分明显增高，肺泡间隔增厚、炎性细胞浸润、肺充血、肺出血都更为严重，提示小鼠脓毒症模型建立成功。

IL-17是Th17细胞的主效应细胞因子。已经证明IL-17涉及多种炎症反应，如自身免疫性疾病、代谢紊乱和癌症[8]。IL-17由广泛分布的天然免疫细胞产生，在宿主防御微生物和炎症性疾病发生发展中起着重要作用，早期研究[9]表明，IL-17可诱导IL-6、TGF-β、一氧化氮和前列腺素等细胞因子在免疫防御反应中发挥促炎作用。多发性硬化病、银屑病、克罗恩病、支气管哮喘等疾病患者都存在着IL-17水平升高。本研究发现Sep组肺组织和血液中IL-17明显高于S组，Han[10]的研究发现脓毒症大鼠的肺组织有大量炎性细胞浸润，肺组织并随着脓毒症的发展而受损。因此，我们有理由相信IL-17等升高与肺组织的损伤有关。

RORγt是Th17细胞的细胞分化转录调控因子，RORγt可诱导原代CD4+T辅助细胞中IL-17及其相关细胞因子IL-17F基因的转录[11]。在Th17的分化启动阶段，IL-6被认为是一个重要组成部分，与TGF-β结合共同刺激下，通过磷酸化STAT3 (STAT3蛋白的活化形式)为调节核翻译因子表达的细胞核机制提供了快速膜，产生IL-17和IL-22[12]。而后进一步自我激活分化为Th17，通过上调RORγt而导致IL-17大量分泌，在IL-23和IL-1B共同刺激下维持Th17细胞在高水平增殖状态。由此可见，RORγt对Th17细胞的增殖分化在炎症反应和免疫调节中有着不可或缺的作用。

右美托咪定(DEX)[13]是一种新型高选择性α2-肾上腺素能受体激动剂，通过作用于突触前膜的α调节两种受体去影响去甲肾上腺素(NE)的释放，已用于重症监护和手术期间的镇静或镇痛。DEX具有镇痛、镇静和交感神经作用，但不会引起呼吸抑制。近年来，国内外学者还提出DEX有强大的抗炎作用。Chen等[14]的研究发现，DEX可以抑制NE的释放，减少活性氧(ROS)的产生，抑制JNK磷酸化，此外，DEX下调线粒体途径中Bax、细胞色素C、裂解的半胱天冬酶9和裂解的半胱天冬酶3蛋白的表达而减少氧化应激，预防大鼠急性肾损伤。在人体研究[15]中，发现中等剂量(0.5 μg/kg)的DEX可以减轻腹腔镜患者的疼痛，还能调节炎症细胞因子的分泌。DEX组与对照组比较，细胞炎症因子CRP和TNF-α明显降低，表明使用DEX能够缓解身体的炎症并保护其免受病原体的侵袭。本实验中，作者研究了DEX对盲肠结扎致脓毒症小鼠血浆和肺组织IL-17及其转录因子RORγt水平的影响，盲肠结扎24 h后Sep组血浆、肺组织中IL-17和肺组织中RORγt水平均较S组显著升高。结果显示，小鼠脓毒症期间血浆、肺组织中含有大量IL-17及RORγt，早期使用DEX处理能降低IL-17和RORγt的水平，提示DEX可抑制炎症因子IL-17及其转录因子RORγt的活化和释放，减轻脓毒症小鼠的肺损伤程度。

综上所述，右美托咪定可通过抑制IL-17及其转录因子RORγt减轻盲肠结扎致脓毒症小鼠的肺损伤。