玉屏风散对紫外线致人皮肤成纤维细胞光老化的防护作用*

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(右江民族医学院，广西 百色 533000)

皮肤老化是一个由内源性和外源性的多种因素引起的复杂的衰老过程。其中由外源性因素如紫外线(ultraviolet，UV)、接触化学物质等引起的皮肤老化称为光老化。在诸多外源性因素中又以由日光中UV的长期反复地照射作用最主要和最突出。经过相关的流行病学调查及研究，临床上许多皮肤病的发病机制已经被证实与皮肤的光老化有密切的关系[1]。可见皮肤光老化不仅影响美观，而且与多种皮肤病及皮肤恶性肿瘤的发生密切相关。

成纤维细胞能分泌的胶原纤维、弹性纤维及基质成分，是皮肤真皮中最主要的细胞类型，成纤维细胞与其分泌的物质一同构成了真皮的主体，其各种生物学特性的改变是皮肤光老化形成的最重要基础[2-3]。人皮肤成纤维细胞在皮肤光老化过程中起着十分重要的作用。

前期研究中我们已经发现玉屏风散能抑制衰老小鼠表皮朗格汉氏细胞形态学的改变，通过补益卫气可以延缓衰老模型小鼠皮肤老化[4]。因此，本研究选用益卫固表的经典方剂玉屏风散，干预紫外线照射所建立人皮肤成纤维细胞光老化模型，观察不同浓度的玉屏风散对光老化人皮肤成纤维细胞DNA甲基化总体水平、β-半乳糖苷酶染色情况及通过透射电镜观察不同浓度玉屏风散对光老化人皮肤成纤维细胞超微结构的影响，以探讨补益卫气对皮肤光老化的防治作用及其机制，为进一步研制开发和临床应用皮肤光老化中医特色防护剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株与实验动物 人皮肤成纤维细胞购自中国科学院干细胞库(编号：SCSP-109)。SD大鼠40只，SPF级，雌雄各半，体重(200.00±10.00) g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证：SCXK(湘)2014-0011。

1.1.2 主要试剂及仪器 玉屏风散(每剂含黄芪15 g、白术5 g、防风5 g)，药材购自康美药业股份有限公司、DMEM(Invitrogen，12430)、FBS(Gibco)、Sodium Pyruvate(Invitrogen，11360-070)、维生素E(索莱宝，V8010)、PBS(索莱宝)、胰蛋白酶-EDTA消化液(索莱宝)、DNA抽提试剂盒 (Epigentek)、MethylFlash Global DNA Methylation (5-mc) ELISA Easy Kit (Epigentek)、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、Gluta固定液(电镜专用，2.5%)(索莱宝)、CO2恒温培养箱；高速台式冷冻离心机、医用超净工作台、紫外线光疗仪(徐州市科诺医学仪器设备有限公司生产，KN-4006A1，KN-4006B1)、组织切片机(德国Leica公司)、透射电子显微镜(日本JEOL公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 含药血清的制备 按随机原则，将40 只大鼠随机分四组，分别为空白血清组、大剂量含药血清组、中剂量含药血清组及小剂量含药血清组。玉屏风散按常规方法煎煮，浓缩至含生药量2 g·ml-1。大、中、小剂量含药血清组大鼠分别用玉屏风散(分别相当于60 kg成人每日用量的10倍、5倍、同倍)进行灌胃，空白血清组灌服等量生理盐水，每日1次，共灌胃7 d，末次灌胃后1 h，取10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，分离血清，经水浴灭活、微孔膜过滤，-80℃冻存备用。

1.2.2 光老化HSF模型的制备 人皮肤成纤维细胞接种至60 mm培养皿中，生长至80%～90%融合时弃去培养皿内培养液，PBS清洗2次后，加入2 ml PBS，放在紫外线光疗仪下照射，紫外线光疗仪与培养皿的距离是5 cm。UV的照射剂量按预实验确定如下，UVA：辐照强度10 mw/cm2，照射时间80 s，UVB：辐照强度10 mw/cm2，照射时间20 s。

1.2.3 实验分组与给药 细胞实验共设置6组，包括正常组、模型组、阳性药组、玉屏风散小剂量组(简称小剂量组)、玉屏风散中剂量组(简称中剂量组)、玉屏风散大剂量组(简称大剂量组)。各组细胞常规培养24 h过夜，弃培养基，分组处理并加入相应药物干预后继续培养48h，进行各项指标检测。各组细胞按如下方案进行处理，正常组：不做处理；模型组：UVA+UVB照射+10%空白血清；阳性药组：UVA+UVB照射+维生素E；小剂量组：UVA+UVB照射+10%小剂量玉屏风散血清；中剂量组：UVA+UVB照射+10%中剂量玉屏风散血清；大剂量组：UVA+UVB照射+10%大剂量玉屏风散血清。

1.3 指标检测

1.3.1 β-半乳糖苷酶染色 经药物干预后的各组细胞衰老情况根据试剂盒说明书进行检测，吸除细胞培养液，PBS清洗1次，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，5 min后弃去，加入适量酸性液，10 min后吸除，PBS清洗后加入染色工作液，用保鲜膜封住预防蒸发，37℃孵育过夜，倒置显微镜下观察染色结果。蓝染的细胞为阳性细胞。每次随机选择3个视野，至少计数100个细胞，计算衰老阳性率，衰老细胞阳性率(%)=衰老阳性细胞数/100个细胞×100%，每组实验重复3次。

1.3.2 DNA总体甲基化水平检测 经药物干预后的各组细胞，根据试剂盒说明书提取DNA，按说明书加样，确保每孔中液体在底部，放于37℃孵育60 min后上洗板机冲洗3次，加5-mc Detection Complex Solution，室温孵育50 min，加入DS，室温放置5 min，当5%PC孔变成深蓝色时，终止反应，待颜色变化完全，酶标仪450 nm处读取OD值。

1.3.3 透射电镜检测 经药物干预后的各组细胞，消化后，用预冷的PBS(pH 7.4)洗1次，1500 r/min离心5 min，弃上清，加入1 ml 2.5%戊二醛溶液，4°固定24 h，逐级乙醇脱水，树脂包埋切片后透射电镜观察。

2 结果

2.1 玉屏风散对光老化人皮肤成纤维细胞模型β-半乳糖苷酶染色的影响 β-半乳糖苷酶染色结果显示模型组较正常组染色深，β-半乳糖苷酶染色阳性率明显升高(P<0.05)，说明人皮肤成纤维细胞光老化模型制备成功，阳性药组、玉屏风散各剂量组染色较模型组浅，见图1；β-半乳糖苷酶染色阳性率明显升高(P<0.05)，说明玉屏风散的干预对于人皮肤成纤维细胞衰老有一定的改善作用。玉屏风散各剂量组与阳性药组对比，以大剂量组抗衰作用效果最佳，与阳性药组作用差异无统计学意义，见图2。

正常组 模型组 阳性药组

小剂量组 中剂量组 大剂量组

图1 各组人皮肤成纤维细胞β-半乳糖苷酶染色结果(×40)

图2 β-半乳糖苷酶染色计数结果

2.2 玉屏风散对光老化人皮肤成纤维细胞模型DNA总体甲基化水平的影响 与正常组相比，模型组DNA总体甲基化水平明显下降(P<0.05)；阳性药组、玉屏风各剂量组与模型组对比DNA总体甲基化水平均有所升高(P<0.05)；其中大剂量组DNA总体甲基化水平的上调作用明显优于阳性药组(P<0.05)，见表1。

表1 各组成纤维细胞DNA总体甲基化水平的比较

注：a：与正常组比较，P<0.01，b：与模型组比较，P<0.01，c：与阳性药组比较，P<0.05

2.3 玉屏风散对光老化人皮肤成纤维细胞模型超微结构的影响 正常组的人皮肤成纤维细胞，细胞形态饱满，电子密度较为均匀，细胞核膜完整，可见核仁，胞浆丰富，细胞器结构完整，线粒体形态规则，体嵴完整，基质丰富。模型组细胞形态发生明显改变，细胞电子密度减低，细胞核膜、核仁不清楚，胞浆成分显著减少，胞浆中可见大量空泡形成，线粒体显著肿胀变形，形态不规则，见图3。

正常组 模型组 阳性药组

小剂量组 中剂量组 大剂量组

图3 各组人皮肤成纤维细胞电镜结果(×6800)

由此可见本次实验造模成功。阳性药组及玉屏风散中、大剂量组细胞，其细胞形态基本完整，电子密度不均匀，核膜仍完整，核仁可见，胞浆成分缩减，胞浆中结构清晰的细胞器数量减少。仅有少量线粒体出现肿胀、空泡化，线粒体嵴部分断裂、溶解，小剂量组细胞线粒体肿胀变形，电子密度高低不一，形态不规则。可见较多的双层或单侧闭合膜结构，内吞有线粒体或其他细胞器的胞浆成分，提示自噬体形成。由上述结果可见，与模型组相比，大中剂量组人皮肤成纤维细胞内细胞器尤其是线粒体的破坏明显减轻，细胞形态也有明显地改善。

3 讨论

机体的衰老是由基因、环境和社会等多方面因素共同决定的[5]，衰老的众多机制中，表观遗传学(epigenetic)是基于非基因序列改变所致的基因表达水平的变化。DNA甲基化作为表观遗传学的重要组成部分，其与衰老有着密切的联系，在衰老过程中，DNA甲基化在基因组上的分布发生显著改变，主要表现为DNA甲基化的总体减少和局部增加。本实验结果显示，正常人皮肤成纤维细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率较低，细胞DNA总体甲基化处于较高水平，细胞形态饱满，细胞核膜完整，细胞器结构完整，线粒体形态规则，体嵴完整。紫外线照射后，细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率明显增加，细胞DNA总体甲基化水平明显下降，细胞超微结构出现线粒体肿胀、细胞核膜内折等显著衰老改变。说明光老化的人皮肤成纤维细胞出现一系列衰老表型的机制可能与细胞DNA甲基化相关。

中医学认为皮肤老化与肺、脾、肾三脏关系尤为密切。“抗衰”多不离调整“气血”的功能状态，气血的化生、运行、贮藏、转化等诸多方面均由脏腑操纵，脏腑是通过对气血的控制来达到延缓皮肤衰老的作用。卫气由水谷之悍气与自然界清气解和而成，依靠中焦脾胃运化的水谷温养，并通过肺的宣发功能布护于全身肌表，同时与肾气的虚衰密切相关，具有护卫肌表、温分肉、肥腠理、充肌肤、司开阖的功能，运行于皮肤、分肉之间。由此可见，卫气在运行分布和功能状态上与皮肤均有着密切的联系，正如《灵枢·本脏》中所云“卫气和，则分肉接利，皮肤调柔，腠理致密矣”。

玉屏风散由黄芪、白术和防风组成，为中医“益卫固表”的经典名方。方中黄芪、白术互为君臣专补脾肺之气，配伍防风祛风散邪，全方共凑补脾实卫、益气固表止汗的功效。有学者研究发现以不同浓度玉屏风散含药血清能够缓解经紫外线照射的光老化角质形成细胞受损的细胞形态，提高紫外线照射后的细胞活力及细胞的克隆形成率，具有抗角质形成细胞光老化的作用[6]。

本研究结果显示，玉屏风散含药血清干预后的细胞中β-半乳糖苷酶染色阳性率较模型组明显下降，细胞DNA总体甲基化水平有所升高，对细胞内细胞器尤其是线粒体的破坏明显减轻，细胞形态也有明显的改善。经大鼠体内代谢后的产物模拟了玉屏风散在人体内的代谢过程，其含药血清中有效成分具有一定的下调光老化HSF 细胞中β-半乳糖苷酶染色阳性率，同时上调DNA总体甲基化水平的作用，作用效果以大剂量玉屏风散含药血清更为显著。

综上所述，玉屏风散对紫外线所致的人皮肤成纤维细胞光老化具有一定的防护作用，其机制可能与调控细胞DNA甲基化相关，在今后的研究中可以进一步探索其调控机制，从而进一步阐明玉屏风散的抗衰机制。