慢性铝暴露对大鼠精子质量的影响*

，，，，，，，

(1. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；3. 右江民族医学院医学检验学院，广西 百色 533000)

铝及铝制品广泛应用于生产和生活中，人类通过职业性、医源性和生活性接触铝。铝主要以离子形式被机体吸收，可分布并蓄积于脑组织、淋巴结、睾丸等多数软组织中。目前，铝对神经系统影响获得了较多研究者的关注[1-2]，而铝对男性生殖尤其是精子质量影响的研究相对较少，其相关机制尚不清楚，而近年来有研究者发现，人的精液铝含量与精子质量减低存在相关性[3-4]。为此，本实验通过建立慢性铝暴露大鼠动物模型，探讨慢性铝暴露对大鼠精子质量影响及其与睾丸超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量的关系，为预防铝暴露引起精子质量减低提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 六水三氯化铝(上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产)，生理盐水(四川科伦药业股份有限公司生产)，Medium 199营养液(美国Gibco公司生产)，精子活体染色液(伊红-苯胺黑法)(北京索莱宝科技有限公司生产)，SOD检测试剂盒(宁波美康生物科技有限公司生产)，脂质氧化终产物丙二醛(MDA)检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司生产)；SCA 精子质量分析系统(西班牙Microptic S.L.公司生产)，生物显微镜(日本Olympus公司生产)，FSH-2可调高速匀浆机(常州市金坛友联仪器研究所生产)，TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司生产)，LABOSPECT 008 AS全自动生化分析仪(日本Hitachi公司生产)。

1.2 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠96只，体重180～200 g，由右江民族医学院实验动物中心提供(生产、使用许可证号：SYXK桂2017-0004)，在实验开始前进行1周的适应性饲养。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与建模 将96只实验大鼠编号，按随机数字表法分成4组，每组24只，参照孙浩[5]的实验设置方法，根据AlCl3致大鼠的半数致死量(Median Lethal Dose，LD50)，结合大鼠每天的体重及饮水量，采用饮水法染铝：高剂量组[1/5 LD50，256.72 mg/(kg·d) ]、中剂量组[1/10 LD50，128.36 mg/(kg·d) ]、低剂量组[1/20 LD50，64.18 mg/(kg·d) ]及对照组[0 mg/(kg·d)]。根据大鼠精子发生的时程[6]，饲养时长设置为2个精子发生时程约16周。

1.3.2 样本采集 饲养结束，给予大鼠禁食不禁水12 h，称量体重，以每100 g体重腹腔注射0.3 ml的10%水合氯醛进行麻醉。分离两侧睾丸及附睾组织，立即称重，睾丸组织用冰生理盐水冲洗并置于滤纸吸干，冰盒中操作将其切成小块，取组织块少许，加至预冷的冰生理盐水中制备成10%的组织匀浆，8000 g 4℃离心10 min，取其上清，置-20℃ 保存待测；附睾组织置于10 ml已预温至37℃的生理盐水中，剪碎，摇匀，37℃温育15 min，使精子充分游出；用70 μm孔径细胞滤网过滤，重复多次，至上清液变清，得到附睾精子悬液，待测。

1.3.3 精子质量分析 取附睾精子滤液200 μl，加入1 ml Medium199细胞营养液中，37℃温育2 min，取10 μl加到预温的精子计数板上，显微镜下数取300个精子，利用计算机辅助精子分析仪(CASA)，参照世界卫生组织的精子运动分类标准[7]，对精子进行分类计数，以精子的(a级+b级)作为前向运动(Progressive motility，PR)，统计其百分比，检测工作于3 min内完成。同时使用伊红-苯胺黑染料，对精子进行活染，测定精子的死精子率。精子形态学检查使用伊红染色法进行。

1.3.4 睾丸组织匀浆SOD、MDA检测 用邻苯三酚自氧化显色法，经日立LABOSPECT 008 AS全自动生化分析仪，测定大鼠睾丸组织匀浆上清的SOD活力；MDA 含量的检测则采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)显色法，在紫外可见分光光度计上进行，检测分析步骤按试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 体重变化 在染铝第1周末，高剂量大鼠体重与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；染铝第2周末，各剂量染铝组大鼠体重较对照组的差异均有统计学意义(P<0.05)；染铝满4周后，中、高剂量组大鼠体重与低剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 染铝对雄性大鼠体重的影响

2.2 大鼠精子质量 持续喂养16周后，与对照组比较，各染铝组的前向运动精子百分比均表现为显著减低(P<0.01)，而死精子百分比及异形精子百分比则显著升高(P<0.01)，见表1。异形精子见图2。

表1 大鼠精子质量检测结果

注：分别与对照组前向运动精子(%)、死精子(%)、异形精子(%)比较，a、b、c：P均<0.01；分别与低剂量组前向运动精子(%)、死精子(%)、异形精子(%)比较，d、e、f：P均<0.01

2.3 睾丸SOD活性及MDA含量 与对照组相比，各剂量的染铝组睾丸SOD活性均明显减低(P<0.01)，且中、高剂量组的SOD活性均明显低于低剂量组(P<0.01)；睾丸MDA含量染铝组明显高于对照组(P<0.01)，且中、高剂量组的MDA含量均明显高于低剂量组(P<0.05)，见表2。

图2 大鼠精子形态图(伊红染色)

注：A:正常精子；B:卷尾；C:折尾；D:尾部鞘膜断裂；E:短尾；F:无尾；G:无头；H:头部畸形

表2 大鼠睾丸SOD活性及MDA含量检测结果

注：分别与对照组SOD、MDA比较，a、b：P均<0.01；分别与低剂量SOD、MDA比较，c、d：P均<0.05

2.4 大鼠精子质量与铝剂量、睾丸SOD活性及MDA含量的相关性分析 在铝染毒条件下，Spearman相关分析结果显示，前向运动精子精子百分比与铝染毒的剂量、MDA含量呈负相关(P<0.01)，与SOD活性呈正相关(P<0.001)；死精子及形态异常精子百分比与铝染毒的剂量、MDA含量呈正相关(P<0.001)，与SOD活性呈负相关(P<0.001),见表3。进一步的分析结果显示，铝染毒剂量与睾丸SOD活性呈负相关(P<0.001)，与MDA含量呈正相关(P<0.001),见表4。

表3 大鼠精子质量与染铝剂量、睾丸SOD活性及MDA含量的相关性分析

表4 染铝剂量与睾丸SOD活性及MDA含量的相关性分析

3 讨论

精子质量下降是生殖医学男科的常见问题，其发生与多种因素有关，有害物质暴露过量是其重要原因之一[8]。铝由于没有已知生物学功能，环境中常被视为有害物质[9-10]。本研究的实验结果显示过量的铝(1/5 LD50、1/10 LD50、1/20 LD50)可对大鼠体重增长产生影响，并且可降低精子质量。而Martinez等[11]的研究结果则表明，铝暴露量在人类日常饮食水平即可对大鼠精子产生负面影响，与本研究结果一致证实铝暴露可降低精子质量。

SOD是机体抗氧化系统中重要的金属酶类，正常生理情况下，机体的活性氧类物质(ROS)保持在较低水平，SOD在其中发挥着重要作用。生理条件下的低浓度ROS对精子是有益的，精子的活化、获能及顶体反应中ROS都发挥着重要作用[12-13]。而精子发生过程中，由于形态结构的变化，精母细胞需要舍弃大量的细胞质转变精子，导致细胞质中的抗氧化酶大量丢失，造成精子抗氧化能力相对不足；精子膜含有高水平的多不饱和脂肪酸，而不饱和脂肪酸是ROS攻击的主要对象之一，这些因素使精子容易受到ROS的损害[14]。此外，线粒体是细胞内产生ROS 的重要场所[15]，而精子细胞富含线粒体，其ROS产生相当活跃。因此，外部坏境的抗氧化作用对精子细胞尤为重要。而精子发生在睾丸进行，睾丸的抗氧化系统对于精细胞至关重要。本实验结果显示，染铝组睾丸组织中SOD 活性显著低于对照组，MDA含量显著高于对照组。提示铝染组大鼠睾丸组织抗氧化系统受损，不能有效地清除组织内的氧自由基，氧自由基作用于细胞内脂质使其发生过氧化反应，使脂质过氧化的最终产物之一的MDA含量升高。本实验的结果还显示，精子质量积极指标的前向运动精子精子百分比与铝染毒剂量、睾丸组织MDA含量呈负相关，精子质量消极指标的死精子及形态异常精子百分比与铝染毒剂量、MDA含量呈正相关，铝染毒剂量与MDA含量呈正相关。而睾丸组织中的 MDA 含量升高会影响到生殖功能[16]，精子质量与 MDA 含量呈负相关[17]。可见铝染毒剂量的增加引起的精子质量的进行性下降，与睾丸组织MDA含量增加有关。

综合本实验的结果，铝可对大鼠精子质量产生负面影响，并且随着铝剂量的增加，精子质量下降明显。结合各组大鼠睾丸SOD活性及MDA含量的差异，铝对精子质量的影响可能与脂质过氧化有关，其分子机制有待进一步研究。