PERK在重症急性胰腺炎大鼠淋巴细胞中的表达及其与细胞凋亡的相关性*

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(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院消化内科，广西 百色 533000)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是临床常见的危急重症，该病发病急，病情严重，进展迅速，且并发症多，病死率高达30%～40%[1]。研究者认为SAP的病理基础是胰腺细胞内酶原的非正常激活，大量酶原异常激活引起胰腺的自我消化以及局部炎症[2]。严重时胰腺坏死，可发生系统性炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，累及胰腺外器官，引起多器官功能障碍(multiple organ dysfunction，MODS)[3]。近年来虽然治疗有了明显的进步，但SAP的死亡率居高不下。研究发现由于SAP晚期淋巴细胞过度凋亡，引起免疫抑制，并发脓毒症，是SAP患者死亡的重要原因[4]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是新近发现的调控细胞凋亡的信号通路，其中起主导作用的有蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-1ike ER kinase，PERK)、活化转录因子6(the activating transcription factor 6，ATF6)和肌醇酶l(inositol requiring enzyme l，IREI) 3种反应感受蛋白。缺乏PERK的细胞不能引起真核翻译起始因子2的α亚单位(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，这种细胞对ERS呈高反应性，PERK信号通路在ERS中的重要性在PERK细胞中或敲除PERK基因的细胞中得到了证明[5]。本研究采用胰胆管插入逆行注射5%牛磺胆酸钠制备SAP大鼠模型，检测各组凋亡标志物Caspase-3的表达以及PERK的表达变化，探讨PERK与SAP淋巴细胞凋亡的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 成年雄性SPF级SD大鼠20只，体重250～300 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证编号：SYXK桂20117-0004；牛磺胆酸钠(美国Sigma生产)；RNAsimple 总RNA提取试剂盒(北京天根生产)；FastKing RT Kit(With gDNase)(北京天根生产)；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(北京天根生产)；PCR引物合成(上海捷瑞生产)；大鼠胱天蛋白酶3(Casp-3)酶联免疫试剂盒(武汉华美生产)。

1.2 动物分组及模型制备 采用随机数字表法将大鼠分为假手术组(SO组)、SAP组。SO组10只，开腹后仅翻动胰腺，即关腹。SAP组10只，采用胰胆管插入逆行注射5%牛磺胆酸钠制备SAP大鼠模型，造模后18 h处死。记录各组动物的生理活动、生命体征、死亡情况。

1.3 标本采集及检测 按照实验分组于18 h后处死动物并取材。10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠。经大鼠腹主动脉穿刺采血，血液凝固后于4℃ 3000 rpm离心15 min，取上清液，EP 管分装后置于-80℃冰箱保存备用。采血后迅速将大鼠处死，快速取出脾脏，立即放入液氮罐内，然后再转入-80℃冰箱保存，用于后续qPCR。取胰腺组织用10%中性福尔马林固定、石蜡包埋，进行常规病理学检查。

1.3.1 胰腺组织病理学检测 用石蜡包埋后制成4 μm厚切片，常规HE染色后光镜下观察，根据Schmidt评分标准，从水肿、炎症、出血、坏死浸润4个方面，双盲进行胰腺病理损伤评分，每张切片随机选取5个高倍视野，观察胰腺组织病理变化。

1.3.2 ELISA检测 采用ELISA法检测大鼠血清Caspase-3含量，ELIAS检测的具体步骤严格按说明书进行，采用全自动酶标仪(Thermofis，美国)进行结果判定。

1.3.3 脾脏组织qPCR检测 PERK基因引物序列：上游5′-GGACTGCCTGGGTCTTTGAT-3′，下游5′-TGTGGGGTCAAACGCCTATT-3′。Caspase-3基因引物序列：上游5′-CTAGCTCCTAGTCTCTGCTCCC-3′，下游5′-TCCGTCCCCAATACGTGTCGAAGTCA-3′。内参GAPDH引物序列：上游5′-AGGGCTACCATGCCAACTTC-3′，下游5′-CCACGTAGTAGA

CGATGGGC-3′。按照说明书所述步骤提取各实验组脾脏组织的总RNA，经紫外分光光度计(TU-1810PC，北京普析)测定OD260、OD280及浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。取1 μg总RNA用反转录试剂盒按说明书方法反转录得到cDNA，并保存在-80℃。应用SYBR Green Master Mix扩增上述cDNA，使用LightCycler○R96 qPCR仪进行检测。选取GAPDH为内参，分析PERK、Caspase-3的mRNA 表达。所有样品均设3个复孔，采用2-△△Ct法计算PERK、Caspase-3 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 大鼠胰腺病理评分 SO组胰腺腺泡结构基本完整，偶见水肿和少量炎性细胞浸润；SAP组可见胰腺腺泡水肿，腺泡结构有不同程度坏死，腺泡间隔及小叶间隔显著增宽，间质内可见红细胞渗出和大量炎症细胞入侵。根据Schmidt评分标准，与SO组比较，SAP组胰腺病理组织学评分有显著性增加(P<0.05)，见图1、图2。

图1 大鼠胰腺组织病理改变(HE 400×)

注：SO组腺泡结构基本完整；SAP组腺泡细胞广泛空泡化、坏死，腺泡结构严重破坏，胰腺间质内可见大量炎细胞浸泡及严重出血

图2 大鼠胰腺病理评分

2.2 大鼠血清中Caspase-3水平 SO组、SAP组血清Caspase-3表达水平分别为(0.62±0.38、1.51±0.11)ng /ml。SAP组18 h血清Caspase-3水平明显高于SO组(t=7.114，P<0.05)。

2.3 大鼠脾脏组织中PERK mRNA相对表达量 SO组脾脏组织PERK mRNA低表达，SAP组PERK mRNA的表达明显升高(P<0.05)，见图3、图4。

图3 PERK mRNA、Caspase-3 mRNA基因扩增曲线及溶解曲线

图4 大鼠脾脏淋巴细胞PERK mRNA相对表达量

2.4 大鼠脾脏组织中Caspase-3 mRNA相对表达量 SO组大鼠脾脏组织中Caspase-3 mRNA活性较低，与SO组比较，SAP组Caspase-3 mRNA活性升高(P<0.05)，见图3、图5。

2.5 大鼠脾淋巴细胞PERK mRNA水平与脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平的相关性 SAP组中脾淋巴细胞PERK mRNA水平与脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平呈正相关(r=0.814、0.875，P<0.05)，随脾淋巴细胞PERK mRNA水平增高，脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平升高，见图6。

图5 大鼠脾脏淋巴细胞Caspase-3 mRNA相对表达量

注：*与SO组比较，P<0.05

图6 SAP组中脾淋巴细胞PERK mRNA水平与脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平的相关性

3 讨论

以往研究认为SIRS是导致SAP病情进展及患者死亡的主要原因。近年研究发现，SAP患者由于外周血淋巴细胞过度凋亡，淋巴细胞亚群明显减少，导致机体免疫抑制及继发感染[6-7]。免疫抑制可促使病情急剧恶化，易并发脓毒症引起MODS，是SAP患者后期死亡的重要原因[4]。本课题组前期的研究工作中，我们也证实SAP患者及小鼠由于淋巴细胞凋亡异常，导致淋巴细胞亚群数量显著减少，与机体免疫抑制、感染及脓毒症并发症密切相关[8-9]。然而淋巴细胞凋亡在大鼠SAP模型中表达如何变化及其可能的分子机制仍不明确。

细胞凋亡经典信号通路有线粒体途径与死亡受体途径。内质网是新近研究发现的一条调控细胞凋亡的信号通路，它是细胞内最大的细胞器，主要维持生理功能[10-11]。适宜的ERS有利于细胞内钙离子及蛋白质的加工等程序的恢复，增强细胞耐受应激刺激的能力；但严重而持续的ERS可以触发反应中相关细胞的凋亡。PERK是具有丝/苏氨酸蛋白激酶的活性的一种内质网I型跨膜蛋白，也是ERS中最先被激活的感受器，被折叠错误的蛋白激活之后抑制错误折叠蛋白的合成，促进内质网功能恢复，维持生理功能。李晓娟等[12]研究证实PERK通路可促进肺癌细胞凋亡。此外，Hiramatsu等[13]在结肠癌细胞系、肝癌细胞系、宫颈癌细胞系中发现PERK磷酸化eIF2α继而下调X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)合成，并通过表达编码转录因子ATF4 ( activating transcription factor 4，ATF4)促进XIAP降解，最终促进细胞凋亡。Xia等[14]的研究证实了在急性胰腺炎胰腺腺泡细胞中PERK的激活可以磷酸化eIF2α，并上调凋亡基因caspase-12和转录因子C/EBP同源蛋白(C/EB phomologous protein，CHOP)的表达。Ma等[15]的研究证实在脓毒症中PERK-CHOP信号通路与淋巴细胞凋亡有密切关系。PERK信号通路是否参与SAP时淋巴细胞凋亡调控，具体参与的分子机制如何至今未见报道。

Caspase-3是多种凋亡途径的共同下游效应部分，在细胞凋亡过程中占据核心地位，被称为“死亡执行蛋白酶”，激活后酶解切割细胞的多种结构和功能蛋白，诱导凋亡发生[16]。本研究，我们采用ELISA法检测血清中Caspase-3的含量及qPCR检测脾淋巴细胞中Caspase-3 mRNA的相对表达量，发现在大鼠SAP模型中Caspase-3的表达水平升高，这与先前的理论、研究以及预测的实验结果相一致。通过这些研究发现大鼠SAP模型中，脾脏淋巴细胞发生了凋亡。另外我们检测了大鼠SAP组及SO组脾淋巴细胞中PERK mRNA表达，结果显示SAP组脾淋巴细胞中PERK mRNA表达水平高于SO组，提示大鼠SAP存在PERK高表达。为进一步研究PERK基因对淋巴细胞凋亡的作用，我们将脾淋巴细胞中PERK mRNA表达水平与脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平结果进行相关性分析，发现SAP组脾淋巴细胞中PERK mRNA与脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平呈显著正相关。提示PERK对Caspase-3呈正向调节作用，PERK高表达使大鼠SAP脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平升高。正常情况下，淋巴细胞 PERK低表达，缺氧、缺血/再灌注等因素导致ERS、PERK表达加剧，诱导CHOP的启动介导大量淋巴细胞凋亡，使淋巴细胞数量减少，机体免疫功能受到损害[17-18]。

本研究结果显示大鼠SAP脾淋巴细胞PERK mRNA表达显著升高，脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平升高，PERK mRNA与Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平呈显著正相关，提示PERK表达对大鼠SAP淋巴细胞凋亡起重要调节作用。因此，明确PERK信号通路调节淋巴细胞凋亡的机制，将可能对SAP患者免疫功能改善及防治继发感染提供理论基础。