野百合碱肺动脉高压大鼠SIRT3和Warburg效应关键酶的变化

肺动脉高压(PAH)是多种心肺血管疾病的重要病理基础。近年来研究发现，Warburg效应通过促进肺动脉平滑肌细胞(PASMC)异常增殖在PAH发生发展中起重要作用，阻断Warburg效应可改善PAH[1-3]。沉默信息调节因子3(SIRT3)是主要的线粒体去乙酰化酶，通过去乙酰化调节线粒体中多种糖代谢酶的活性，促进葡萄糖氧化磷酸化，在调节葡萄糖代谢中发挥重要作用，其表达或活性下调可导致葡萄糖代谢途径的改变[4]。本研究拟探讨野百合碱(MCT)诱导PAH大鼠(MCT-PAH大鼠)模型SIRT3表达的变化及是否存在Warburg效应，为研究Warburg效应在PAH中的作用及可能的触发机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

健康清洁级2月龄SD雄性大鼠16只购自南华大学动物部[许可证号为SCXK(湘)2015-0002]。MCT购自美国Sigma公司；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自江苏碧云天生物研究所；二甲氨基偶氮苯(DAB)免疫组织化学试剂盒购自北京康为生物世纪公司。SIRT3兔源单克隆抗体、葡萄糖转运体1(Glut1)鼠源多克隆抗体、葡萄糖转运体4(Glut4)鼠源多克隆抗体、乳酸脱氢酶(LDH)兔源单克隆抗体和丙酮酸脱氢酶(PDH)兔源单克隆抗体购自英国Abcam公司；β-actin鼠源单克隆抗体、单羧酸转运蛋白4(MCT4)兔源多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗、HRP标记的羊抗鼠二抗购自美国Santa Cruze Biotechnology公司。5810R型低温高速离心机购自德国Eppendorf公司、VE180型Western blot全套设备购自上海天能科技有限公司；PHILIPS EPIQ7C(S12-4探头)超声仪器购自荷兰飞利浦公司；Nikon Eclipse E100 显微镜购自日本Nikon公司。

1.2 动物实验

16只2月龄SD大鼠体质量180～230 g，适应性饲养1周后按随机数字表法分为对照组和MCT组，每组8只，建模第1天MCT组大鼠腹腔注射1%MCT溶液(60 mg/kg)，对照组注射等体积生理盐水。

1.3 超声检测

建模第28天，称重，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定，肢体连接电极记录心电图，大鼠胸部用脱毛膏脱毛，涂预热超声耦合剂，经胸超声心动图检测右心功能的各项指标，包括肺动脉血流加速时间(PAAT)、三尖瓣收缩期位移(TAPSE)、右心室内径(RVID)。

1.4 右心室收缩压测定和右心室肥厚的检测

采用右心导管法测量右心室收缩压(RVSP)，引导器引导下从右颈总静脉将PE50导管插入肺动脉，观察BL-420S生物机能系统记录界面的压力波，波形稳定1 min后记录RVSP。记录结束后分离肺组织和心脏组织，分别称量右心室(RV)、左心室(LV)+室间隔(S)的质量，计算RV/(LV+S)的比值。

1.5 Western blot法检测

取20 mg新鲜或冷冻肺组织，匀浆后4 ℃、12 000 r/min 离心30 min，取上清，测定蛋白含量。蛋白煮沸变性后，SDS-PAGE 电泳1.5 h，电转2 h，封闭2 h。分别按照1∶400、1∶500、1∶200、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000的浓度加入Glut1、Glut4、MCT4、PDH、LDH、SIRT3、β-actin一抗，4 ℃孵育过夜。按照说明书的比例室温孵育二抗45 min。采用Western blot荧光检测试剂盒显影，AlphaImager 2200图像处理系统进行图片灰度扫描并分析目的蛋白条带的相对灰度值。

1.6 免疫组织化学染色

大鼠肺组织石蜡包埋，5 μm组织切片，采用生物素-链霉亲和素-HRP法进行免疫组织化学染色，Glut1、Glut4、MCT4、PDH、LDH、SIRT3单克隆抗体浓度分别为1∶100、1∶100、1∶100、1∶200、1∶200、1∶200，阴性对照使用非特异血清代替一抗，显微镜下观察染色结果，细胞浆呈棕黄色者为阳性细胞。

1.7 肺动脉重构的病理检测

大鼠肺组织石蜡包埋，5 μm组织切片，苏木素伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肺血管病理改变，应用Leica Q550CW图像处理与分析系统测量肺动脉的相对中膜厚度(RMT)及相对中膜面积(RMA)。

1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析，数据采用均值±标准差表示。对数据进行Levene方差齐性检验，结果显示数据均呈正态分布，两组数据的总体方差齐。两组间比较使用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功建立PAH模型大鼠

SD大鼠腹腔注射28 d后进行超声检测，与对照组相比，MCT组的PAAT明显下降，RVID明显增大，TAPSE明显缩短(P均<0.05)，见图1；右心导管法检测显示，MCT组RVSP较对照组明显增加(P< 0.01)；对心室组织进行称量，MCT组RV/(LV+S)较对照组明显增加(P<0.01)。见表1。

注：PAAT为肺动脉血流加速时间；RVID为右心室内径；TAPSE为三尖瓣收缩期位移；RV为右心室；RA为右心房；LV为左心室；LA为左心房

表1 各组大鼠超声心动图指标比较

2.2 大鼠肺动脉结构改变

HE染色结果显示，MCT组大鼠肺小动脉管腔狭窄，血管周围炎性细胞浸润；与对照组相比，MCT组肺小动脉血管壁明显增厚[(378.47±129.97) μm对(105.16±61.17) μm,P<0.05]，见图2。

注：A为对照组；B为MCT组

2.3 肺组织中Warburg效应关键酶和SIRT3的表达

Western blot法检测肺组织中Warburg效应关键酶和SIRT3的表达情况，结果显示，MCT组大鼠肺组织中Glut1、Glut4、LDH、MCT4蛋白表达水平较对照组明显升高，PDH和 SIRT3蛋白表达水平较对照组明显降低(P均<0.05)，见图3、表3。

图 3 各组大鼠肺组织Warburg效应关键酶和SIRT3蛋白表达水平

表3 各组大鼠肺组织Warburg效应关键酶和SIRT3蛋白表达水平比较

2.4 肺动脉血管中Warburg效应关键酶和SIRT3的表达

免疫组织化学染色法检测肺血管中Warburg效应关键酶，与对照组相比，MCT组大鼠肺小动脉中膜Glut1、Glut4、LDH、MCT4的蛋白表达水平明显升高，PDH和SIRT3的蛋白表达水平明显降低(P均<0.05)，见图4、表4。

3 讨论

Warburg效应又称有氧糖酵解，1956年，Warburg发现恶性肿瘤细胞在有氧条件下糖酵解途径明显增强，伴随葡萄糖摄取增加，乳酸生成增加，该现象此后被称为Warburg效应[5]。研究发现，PAH动物模型和患者中存在与Warburg效应相关的线粒体代谢方式改变[6]，为进一步明确PAH时血管局部是否存在Warburg效应，本研究采用Western blot和免疫组织化学染色法分别检测了MCT-PAH大鼠肺组织和肺小动脉，结果显示MCT-PAH大鼠肺组织和肺小动脉Warburg效应关键酶Glut1、Glut4、LDH、MCT4表达上调，且以上表达变化主要位于MCT-PAH大鼠肺小动脉中膜，表明肺动脉局部存在Warburg效应。

SIRT3是沉默信息调节因子(SIRT)蛋白家族成员，是主要的线粒体去乙酰化酶[7]，其表达或功能失调在恶性肿瘤[8]、PAH[9]、心室重构[10]等的发生发展中起重要作用。SIRT3 通过去乙酰化调节线粒体中多种糖代谢酶的活性，发挥调节葡萄糖代谢的作用[4]，主要方式为去乙酰化激活乙酰辅酶A 合成酶2[11]、丙酮酸脱氢酶磷酸酶[12]、异柠檬酸脱氢酶[13]、琥珀酸脱氢酶[14]，从而促使葡萄糖通过氧化磷酸化途径代谢。Paulin等[9]证实MCT-PAH大鼠肺动脉线粒体SIRT3 表达下降，并伴随线粒体蛋白乙酰化程度增高，通过基因治疗上调SIRT3 表达可逆转PAH[9]。本研究中Western blot结果显示MCT-PAH大鼠肺组织中SIRT3表达下调，与Paulin等[9]的研究结果一致，免疫组织化学染色显示肺小动脉中膜SIRT3表达下调明显，提示SIRT3表达下调可能通过调节糖代谢通路在PAH发病中起重要作用。

图 4 各组大鼠肺小动脉Warburg效应关键酶和SIRT3免疫组织化学染色结果

表4 各组大鼠肺小动脉Warburg效应关键酶和SIRT3蛋白表达水平比较

Warburg 效应的关键调节酶之一是PDH，正常细胞在氧供充足时PDH活化，葡萄糖通过氧化磷酸化途径代谢，维持细胞三磷酸腺苷(ATP)供应正常，缺氧条件下PDH活性受抑制，导致葡萄糖氧化磷酸化途径受抑，进而通过糖酵解途径代谢，导致ATP 产量下降[12]。本研究证实，MCT-PAH大鼠模型肺小动脉中膜PDH 表达下降，并伴随Warburg 效应关键酶表达升高，提示肺小动脉局部存在Warburg效应，PDH表达下调可能为其触发原因之一。PDH与丙酮酸脱氢酶磷酸酶1(PDP1)、PDK1组成丙酮酸脱氢酶复合体并受二者双重调节，PDP1催化PDH去磷酸化活化、PDK1催化PDH磷酸化失活。近期研究显示，PDH不仅受磷酸化调节，同时还受乙酰化调节，PDH乙酰化时活性亦受到抑制。Fan等[12]研究发现恶性肿瘤细胞PDH、PDP1乙酰化程度升高，并伴随Warburg 效应，通过基因干预抑制PDH、PDP1乙酰化可逆转Warburg 效应并抑制恶性肿瘤生长。Ozden等[15]发现乙酰化程度升高导致PDH失活，SIRT3可直接通过催化恶性肿瘤细胞PDH去乙酰化而增加其活性；心肌细胞SIRT3功能被抑制或表达下调时，PDH复合体乙酰化程度升高，PDH 失活，进而导致线粒体氧化磷酸化受抑[16]。以上研究表明，SIRT3 表达下调或功能被抑制时，不仅通过乙酰化抑制PDP1，导致PDH磷酸化失活，而且可直接催化PDH乙酰化，抑制其功能，从而促使葡萄糖代谢向Warburg 效应转化。本研究结果证实，MCT-PAH肺小动脉局部SIRT3表达下调，推测其表达下调可能导致PDH乙酰化失活，从而进一步增强Warburg效应，因此SIRT3的表达下调引发的PDH活性下降可能也是MCT-PAH大鼠Warburg效应的始动因素之一。

综上所述，本研究发现MCT可诱导大鼠PAH形成，MCT-PAH大鼠肺组织存在Warburg效应关键酶表达上调和SIRT3表达下调，该研究为探讨Warburg效应在PAH中的作用及可能的触发机制提供了实验基础。