Janus激酶及其抑制剂的研究进展

黄昊哲，张吉星，刘佳，徐云根，孙丽萍

（中国药科大学药学院药物化学教研室 江苏省药物分子设计与成药性优化重点实验室，江苏 南京210009）

Janus激酶（Janus kinases，JAKs）是一种细胞内的非受体酪氨酸激酶，在许多细胞因子受体介导的信号传导中起到枢纽作用[1]。JAKs参与的信号通路可由多种细胞因子、生长因子以及受体激活，在生物体中参与多种类型细胞的增殖、分化、凋亡，血管生成以及免疫调节等重要的生理过程。同时JAKs的失调通常伴随着各种疾病，故其成为具有吸引力的靶标[2]。截至目前，已经有3个JAKs抑制剂被批准上市，并有多个JAK抑制剂被批准进行临床试验，表现出良好的开发前景[2-3]。本文将对JAKs家族及其抑制剂研究状况，以及针对的适应证进行概述。

1 Janus激酶家族的生物学研究

1.1 Janus激酶家族及其结构

JAKs家族在哺乳动物体内有4个不同的亚型，分别为：JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，TYK2）。JAKs存在于细胞质中，常分布在核内体和质膜上。除JAK3主要表达于造血细胞外，其他3种亚型均在成年小鼠组织中普遍表达[4]。

JAKs家族的结构具有高度的同源性，由7个同源结构域（JAK homology domain，JH）组成4个保守结构域：C端的假激酶区（pseudo-kinase domain，JH2）和激酶区（kinase domain，JH1），以及N端FERM（Four.1 protein，Ezrin，Radixin，Moesin） 区 和 SH2结 构 域（srchomology 2 domain）（见图 1）[5]。其中 JH1区是能够活化激酶的催化区域，该区域在JAKs家族中高度保守，一旦JAKs与细胞因子结合，JH1中活化环（activation loop）上的酪氨酸残基发生磷酸化，伴随着蛋白构象发生变化，随之激活蛋白及其下游信号通路[6]；研究表明JH2在JH1功能的调控上发挥着重要作用，该结构域内的突变常导致JAKs活性异常，进而导致某些疾病的发生[5]；JH3和JH4组成了SH2结构域，被认为能够起到稳定JAKs构象的作用；JH5～JH7（FERM区）能与细胞因子受体胞内区域发生相互作用，调节 JAKs与受体的结合[7]。

图 1 Janus激酶结构域Figure 1 Domains structure of Janus kinase

1.2 Janus激酶参与的信号通路

JAKs/信号传导及转录激活因子（signal transducers and activators of transcription，STATs） 信 号 通 路 是JAKs在生物体内介导的最主要的通路，当胞外配体结合在膜表面的细胞因子受体上时，该通路启动。此时2个JAKs分子靠近细胞因子受体，导致受体胞质内区域构象发生改变，启动并激活JAKs蛋白，同时JAKs使得受体胞质内区域发生磷酸化，在该区域内给STATs提供停泊位点（docking sites）。激活的STATs蛋白从受体上脱离并形成磷酸化二聚体，转移至细胞核内，结合在特定的DNA序列上发挥生理功能，调控目标基因的转录[8-9]。该通路的激活调控了一系列的生理过程，如造血和细胞代谢等[10]。同时有文献报道，激活的JAKs也能够介导其他下游级联信号，包括磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，也称 Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和Ras/Raf/有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase kinase，MEK)/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）下游信号通路（见图2）[11]。

1.3 Janus激酶与细胞因子

JAKs介导的信号通路能够被多种细胞因子、生长因子和激素激活。然而特定的细胞因子只能与特定的受体结合，激活并启动下游特定的JAKs亚型复合物，在相关的生理活动中发挥重要作用（见图3）。如JAK1/3复合物是唯一能够被含有γ链的细胞因子受体激活的JAKs家族复合物[4]，包括白细胞介素（interleukin，IL）-2、4、7、9、15和21等细胞因子，该复合物对淋巴细胞的增殖和体内稳态起到关键作用[10]。含有β亚基的Ⅰ型细胞因子和激素类细胞因子能够刺激JAK2同源二聚化，JAK2是骨髓、红细胞和血小板生成必不可少的因素[3-4]。干扰素（interferon，IFN）家族可激活JAK1/TYK2复合物[3]。IL-10家族细胞因子和含有糖蛋白130（glycoprotein130，gp130）的细胞因子，介导JAK1/2和TYK2的下游信号通路[4]，如IL-6首先激活JAK1/TYK2复合物，再启动JAK2/TYK2复合物[10]。

图 2 Janus激酶参与的信号通路Figure 2 Involvement of Janus kinase in signaling pathway

2 Janus激酶通路与疾病的关系

近年来，JAKs通路与疾病的关系越来越受到关注。过度活跃的JAKs在人类炎症、自身免疫性疾病和骨髓增殖性疾病中有明确的作用[2,4,12-16]。因此，JAKs抑制剂的开发日益引起重视。

2.1 类风湿性关节炎

据报道，多种细胞因子在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的病理过程中具有关键作用，这些细胞因子通过不同途径激活JAKs/STATs信号通路[13]。因此，JAKs蛋白在RA的病理过程中起到关键作用，而靶向抑制JAKs已是目前临床上用于治疗RA的有效手段[14]。

2.2 骨髓增殖性肿瘤

骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）是以骨髓中异常造血干细胞增殖为特征的一组慢性病症，包括骨髓纤维化（myelo fi brosis，MF）、真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）、原发性血小板增多症（essential thrombocytosis，ET）和慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）[15]。异常的JAK2信号在MPN的发病机制中起关键作用。95%的PV患者，以及约50% ～ 60%的MF和ET患者具有JAK2的V617F突变[2,4-5,16]。该突变导致JAK2不依赖细胞因子连续激活，并活化下游信号通路[2]。

图 3 细胞因子和生长因子刺激的Janus激酶通路[1]Figure 3 Janus kinase signaling pathway stimulated by cytokine and growth factor

2.3 白血病

据报道，在急性淋巴细胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患者中发现了JAK1/3和TYK2的突变[4]；有9%的儿童急性T淋巴细胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）患者出现了IL-7Rα的插入序列，这导致分子间2个半胱氨酸残基二硫键发生二聚化，允许JAK1在缺乏JAK3和γ链的情况下活化[2]。在187例急性B淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者中，有20例发生JAK1、JAK2或JAK3突变[2]。

此外，急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者中也检测到JAK1的突变[5]；同时在临床试验中发现了多名患者被检测到JAK2-V617F突变[2]。这些发现意味着特异性靶向JAKs的抑制剂在治疗这些疾病中将起到有益作用[5,16]。

2.4 淋巴瘤

淋巴瘤（lymphoma）是由成熟的免疫细胞产生的恶性肿瘤。据报道，32%的自然杀伤细胞/T细胞淋巴瘤患者存在JAK3点突变[4]。55%的原发性纵隔B细胞淋巴瘤（primary mediastinal B-cell lymphoma，PMBL） 患 者和35%的霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL）患者都含有9p24染色体的扩增，涉及的基因包括JAK2[2]。

2.5 银屑病

银屑病（psoriasis）是一种自身免疫性皮肤病，响应于多种细胞因子，包括肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-17、IL-12和IL-23[17]。其中，IL-23通过JAK信号通路刺激TH17细胞产生细胞因子IL-17，其是银屑病发生中另一个重要的致病因子[18]。鉴于银屑病进程依赖于细胞因子介导的JAKs通路，使用JAKs抑制剂阻断上游IL-23信号能够间接导致IL-17减少，从而抑制银屑病的发生[18]。

2.6 特应性皮炎

在特应性皮炎（atopic dermatitis）中，一些与变应性疾病相关的细胞因子（如IL-4、IL-5和IL-13）过度表达[17-18]。过度表达的细胞因子激活下游的JAKs蛋白，促进疾病的发展，因此抑制这些下游的JAKs蛋白能够起到很好的疗效[17]。

3 Janus激酶抑制剂

截至2018年3月，已经有很多JAKs抑制剂用于临床或处于临床前研究阶段。从临床试验药物以及上市药物来看，目前针对JAK1/3的抑制剂的主要适应证为RA，而针对JAK2靶点开发的抑制剂的适应证主要为MF、PV等疾病。以下主要按照化学结构对JAKs抑制剂进行分类。

3.1 吡咯并嘧啶类

吡咯并嘧啶是JAKs抑制剂中最常见的一种结构，母核中吡咯上的-NH-和嘧啶N1能与激酶铰链区形成关键氢键。辉瑞公司采用高通量筛选得到先导化合物CP-352，664（1），并通过结构改造得到托法替尼（tofacitinib，2），是首个上市用于治疗自身免疫性疾病的JAKs抑制剂[19]。多项临床研究表明，托法替尼对于不同严重程度的RA患者都有效，且与阿达木单抗疗效相当，疗效优于甲氨蝶呤[19]。基于这些发现，美国FDA批准将托法替尼用于治疗对甲氨蝶呤应答欠佳的RA患者[19]。在开发初期，托法替尼旨在靶向抑制JAK3的活性（IC50=1 nmol · L-1），但后期研究发现其几乎对整个JAKs家族都有活性（对JAK2和JAK1的IC50分别为 20 和 112 nmol · L-1）[20]。同时有临床试验报道患者使用托法替尼后出现贫血、血小板减少等症状，很可能与JAK2抑制有关。

鲁索利替尼（ruxolitinib，3）是由Incyte公司开发的JAK1/2选择性口服抑制剂，用于治疗MF和PV。鲁索利替尼在体外对JAK1和JAK2的IC50分别为（3.3±1.2）和（2.8±1.2） nmol · L-1，对 JAK1/2 的 IC50分别是对TYK2和JAK3的6倍和100倍[21]，并能够显著延长JAK2-V617F阳性MPN模型小鼠的存活期[21]。临床试验表明：在减少高危MF患者的脾肿大和其他相关症状方面，鲁索利替尼具有显著且持久的疗效[22]，并且在那些未携带JAK2-V617F突变的患者中也表现出良好的疗效[23]。

巴瑞克替尼（baricitinib，4）是一种强效的JAK1/2选择性抑制剂（对JAK1和JAK2的IC50分别为5.9和5.7 nmol · L-1），对JAK3和TYK2有优异的选择性（JAK3：IC50＞ 400 nmol · L-1；TYK2：IC50=53 nmol · L-1）[24]。2017年，该产品在日本被批准用于治疗中度至重度RA。巴瑞克替尼对RA的疗效在Ⅲ期临床试验中得到证实[24-25]，对难治性侵袭性RA患者的关节损伤有显著改善，且未出现严重副作用[26]。

化合物PF-04965842（5）是JAK1选择性抑制剂（IC50=29 nmol · L-1）。开发者以托法替尼为先导化合物，修饰托法替尼尾部3-氨基哌啶为磺酰胺结构。化合物5与JAK1和JAK2的X射线共晶的结果证实了该化合物对JAK1的活性优于JAK2[27]。该化合物在生化实验中对JAK2亚型选择性良好，在动物实验中对抗原诱导关节炎（adjuvant-induced arthritis，AIA）大鼠模型有显著疗效[27]；目前其治疗特应性皮炎的Ⅲ期临床试验正在进行中。

3.2 氨基嘧啶类

Pacritinib（SB1518，6）对Fms样酪氨酸激酶3（Fms-like tyrosine kinase，FLT3） 和 JAK2的野生型和突变型都有抑制作用（FLT3wt/FLT3D835Y：IC50分别为22 和 6 nmol · L-1；JAK2wt/JAK2V617F：IC50分 别 为 23 和19 nmol · L-1[28]）。化合物6与JAK2的对接显示：氨基嘧啶与JAK2的ATP结合区中Leu932作用，连接链中氧原子与Ser936形成氢键，吡咯烷的碱性氮与Asp939形成盐桥（见图4）[29]。Pacritinib显示了良好的安全性，在原发性和继发性MF患者的临床研究中具有良好的疗效，为MF患者提供了潜在的治疗选择[30-31]。

Momelotinib（CYT387，7）是一种口服的JAK1/2选择性抑制剂（对JAK1和JAK2的IC50分别为11和18 nmol · L-1），吉利德（Gilead）公司正在对其进行Ⅲ期临床试验，用于治疗PV、MF和ET。细胞实验表明：momelotinib能抑制由细胞因子介导的增殖，并阻止JAK2-V617F阳性PV患者的红细胞集落生长[32]。在小鼠MPN模型中，momelotinib使白细胞计数、血细胞比容和脾脏大小正常化，并恢复炎性细胞因子至正常生理水平[33]。此外，临床试验在评估momelotinib的有效性和安全性上，与上市药物鲁索利替尼相比并不逊色[34-35]。

图 4 化合物6与Janus激酶2对接模式图Figure 4 Docking mode of compound 6 and Janus kinase 2

体外试验表明，JAK2抑制剂NS-018（8）有效地抑制了骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）患者骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs） 的 形 成， 其 对 正 常BMMNCs的毒性相对较低[36]。NS-018治疗MF的Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在进行中。临床研究表明：其最常见的药物相关不良事件是血小板减少症、贫血、头晕和恶心；56%的患者的脾脏大小减少了约50%，且MF相关症状得到了改善[37]。

3.3 三元稠杂环类

Kulagowski等[38]在分子模拟研究中发现托法替尼处于顺势构象时能量最低，同时托法替尼与JAK1的X射线共晶结构图也显示其处于顺势构象。基于以上结论，作者对托法替尼母核进行环化，将咪唑引入吡咯并吡啶母核。模拟托法替尼与JAK1结合模式，得到新型咪唑并吡啶并吡咯骨架化合物9。此外，还有文献报道了化合物10 ～ 12在咪唑C2引入取代基能够与JAK1的Glu966作用，提升化合物对JAK1的活性和选择性[39-41]。

Hurley等[42]通过骨架跃迁由咪唑并吡啶并吡咯得到新型母核（化合物13）。共晶结构显示原母核与新型母核以相同模式结合在JAK1上。母核中吡咯并吡啶能与铰链区Leu959和Glu957形成氢键；腈基伸出铰链区与氨基酸残基作用。

Upadacitinib（ABT494，14）是由艾伯维（AbbVie）公司开发的，以吡咯并吡嗪并吡唑为母核的一种非竞争性JAK3三环抑制剂，其通过与ATP结合位点外的其他区域相互作用提高了对JAK1的选择性，对JAK1、JAK2、JAK3和 TYK2的 IC50分 别 为 43、200、2 300、4 700 nmol · L-1[43]。在细胞特异性评价中，该化合物对JAK1的选择性分别为对JAK2和JAK3的74和58倍[43-44]。目前正在进行一项Ⅲ期临床试验，考察upadacitinib对传统或生物抗风湿药物治疗无效的中度至重度RA的疗效。在其治疗RA的Ⅱb期临床试验中，对于美国风湿病协会（ACR）规定的指标达20%、50%和70%的缓解（即ACR20、 ACR50和ACR70应答）的患者比例而言，治疗组高于安慰剂组，并存在显著的剂量-效应关系（P＜0.001）[45-46]。

3.4 共价抑制剂

PF-06651600（15）是JAKs抑制剂中首个共价抑制剂，其结构中的丙烯酰胺基团能够特异性与JAK3亚型上的Cys909发生加成反应形成共价结合，目前正处于Ⅱ期临床，体内疗效良好且清除率低。PF-06651600以托法替尼为先导化合物，移除嘧啶氨基上的甲基，使得N-C键旋转180°促进尾部片段靠近Cys909，并引入迈克尔受体与Cys形成共价作用而得，实现了JAK3亚型特异性，IC50为 33 nmol · L-1[47-48]。

Tan等[49]报道了具有高选择性JAK3抑制活性的2，4-二取代嘧啶类化合物16和17，其中化合物17对 JAK3 的 IC50低于 0.5 nmol · L-1，在转染的 Ba/F3 细胞试验中，化合物对JAK3的选择性分别为对JAK1、JAK2、TYK2的110、210、110倍。X射线共晶结构图显示，化合物16母核氨基嘧啶部分与JAK3铰链区Leu905形成双齿氢键，丙烯酰胺部分与Cys909形成共价键，氯原子与Met902形成氢键，右侧苯环与Leu956形成范德华力，另外酰胺能与Arg953羰基形成氢键（见图5）。

图 5 化合物16与Janus激酶3的X射线共晶结构[49]Figure 5 X-ray cocrystal structure of Janus kinase 3 in complex with compound 16

Kempson等[50]于2017年报道了新型的JAK3共价抑制剂18，作者以可逆的JAK3抑制剂（19）作为先导化合物，化合物19与JAK3对接显示吡啶和酰胺N能与铰链区形成2个关键氢键，尾部苯环片段伸向特异性Cys909（见图6）。作者在先导化合物尾部引入丙烯酰胺基团，其能够与Cys909加成形成共价键，得到了最优化合物18，酶活性和药动学参数优异（对JAK3的 IC50为 1.3 nmol · L-1）。

3.5 其他

Filgotinib（GLPG0634，20）是 JAK1选择性抑制剂，在动物关节炎模型中能够延缓疾病的进展，与依那西普效果相当，并呈现显著的剂量依赖[51]。在治疗RA的Ⅱb期临床试验中，与安慰剂组相比， fi lgotinib作为单一疗法在治疗活动性RA的体征和症状方面表现出显著性差异，且耐受良好[52]。

Pe fi citinib（21）是Astellas Pharma制药公司开发的JAKs抑制剂，其用于治疗RA的Ⅲ期临床试验正在进行中。与安慰剂相比，ACR20应答率显示出显著的统计学差异，且未见有严重感染病例的报道[53]。

图 6 化合物19与Janus 激酶3对接模式图Figure 6 Docking model of compound 19 and Janus kinase 3

4 总结与展望

目前已证实JAKs在细胞增殖和分化过程中起到了重要的作用，JAKs通路中蛋白活性的改变将导致通路信号传递的改变，进而影响细胞功能。已有众多文献报道JAKs与人类疾病的关系，包括自身免疫性疾病、恶性肿瘤和血液疾病。基于JAKs家族在人体生理和病理过程中的关键作用，选择性抑制JAKs的某些亚型可以有效治疗相关疾病，而抑制其他亚型可能会导致不必要的副作用。例如，在对上市药物托法替尼的临床研究中发现，使用该药物后会导致某些不良反应，包括感染、结核、肿瘤和肝损伤等，研究表明其对几乎所有JAKs亚型都有活性，而上述不良反应被认为可能与之相关。与此同时，已有文献阐明不同的JAKs亚型介导不同的生理活动，而其突变也会导致不同的疾病[5,16]。例如，与其他亚型不同，JAK2作为促红细胞生成素下游的信号蛋白，其失调会导致严重的造血功能紊乱和肿瘤；而消除JAK3的功能将导致严重的联合免疫缺陷[5,16]。TYK2参与干扰素受体的信号，其缺陷导致各种复杂的临床表现，其中包括特应性皮炎和对各种病原体的易感性[5, 16, 43]。

因此，药物开发人员需要明确JAKs亚型所对应的适应证，在药物研发过程中避免不必要的不良反应。同时，相信随着分子生物学对JAKs通路研究的不断深入，开发JAKs选择性抑制剂将取得重大进展，为自身免疫性疾病和肿瘤等疾病的治疗提供新的思路。