游离二氧化硫与葡萄酒氧化褐变及氧化还原电位的相关性分析

苏昊，何志刚，李维新*，任香芸，林晓姿，林晓婕,梁璋成

1(福建省农产品(食品)加工重点实验室，福建 福州，350013) 2(福建省农业科学院，农业工程技术研究所，福建 福州，350003)

氧化褐变是葡萄酒生产过程中极易发生的重要问题之一，当葡萄酒与氧过度接触后，酒体通常会被氧化成褐色，并伴有令人不愉快的氧化味，导致葡萄酒品质下降。同时还容易造成葡萄酒中有害好氧微生物的生长繁殖，产生醋酸等对酒体风味质量不利的代谢产物[1-2]。影响葡萄酒氧化褐变的因素有氧气、酚类、黄酮类、SO2、抗坏血酸、金属离子等[3-5]，其中氧气含量的影响起着决定性的作用。虽然少量的氧气对葡萄酒具有一定的陈酿熟化作用，但过量的氧气会导致酒体的过度氧化[6-8]，因此避免葡萄酒与氧气过度接触是控制葡萄氧化褐变的有效手段。

目前葡萄酒生产中防止氧化褐变的方法主要有满罐贮藏、填充氮气、添加SO2、适度降低贮藏温度等，其中SO2的应用最为广泛。SO2在较低浓度的情况下即具有抗菌、抗氧化、抗酶等多种作用[9-10]。一些研究学者尝试通过脉冲电场、高压和超声波等物理方法或添加羟基酪醇等天然物质来替代SO2，但效果均无法与SO2相比拟[11-12]。SO2在葡萄酒中主要以游离态和结合态2种形式存在，但起到抗氧化作用的主要是游离态的SO2，有效防止葡萄酒氧化的游离SO2含量通常为20～40 mg/L[13-14]。葡萄酒中添加过量的SO2对人体有害，国际葡萄酒组织(International Vine and Wine Organization，OIV)及我国葡萄酒国家标准中规定，葡萄酒中游离SO2的含量不得高于50 mg/L，因此在葡萄酒加工中如何正确适量使用SO2极其重要。氧化还原电位(oxidation-reduction potential，ORP)作为能够反映葡萄酒中氧化还原能力的综合性指标，其变化有助于了解葡萄酒的电化学性质，分析葡萄酒的氧化进程，而葡萄酒中SO2的含量也影响着其ORP[15]，且ORP可以实现在线监测。本研究以桂葡1号葡萄酒和刺葡萄酒为对象，分析不同游离SO2含量的酒样在加速氧化褐变过程中游离SO2、褐变程度、ORP的变化，并探讨游离SO2、氧化褐变与酒中ORP之间的关系，研究游离SO2含量对葡萄酒氧化褐变的抑制作用，通过ORP的监测预警葡萄酒的氧化褐变，可为葡萄酒加工中减少使用SO2提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄酒：福建省农产品(食品)加工重点实验室研发的桂葡1号葡萄酒(2016年生产)和刺葡萄酒(2015年生产)，试验酒样的主要理化指标如表1所示。

仪器：去极化自动氧化还原电位测定仪(FJA-6型)，南京传滴仪器设备有限公司;酸度计(868型)，ORION；紫外可见分光光度计(岛津UV-1750)，日本岛津公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

柠檬酸、Na3PO4、NaOH、葡萄糖、亚硫酸等均为分析纯，其中亚硫酸的SO2含量≥6.0%。

表1 试验酒样的主要理化指标Table 1 Main physicochemical indexes of wine samples

1.2 试验方法

1.2.1 酒样的加速氧化褐变方法

参考SIOUMIS等的方法[16]，并经过调整：2种葡萄原酒在原有游离SO2含量的基础上，分别按体积分数为0、0.5、1.0、1.5 mL/L添加亚硫酸，制成含不同游离SO2的酒样，之后于250 mL的玻璃瓶中加入200 mL不同处理葡萄酒样，加盖密闭，置于(40±1)℃恒温干燥箱中避光处理49 d。每个样品设3次重复，第1、2、3、7天分别取样1次，之后每7 d取样1次，取样置于20 ℃恒温箱中恒温2 h后，分别检测酒样的褐变程度、游离SO2、ORP。其中：桂葡1号葡萄酒按游离SO2含量从低到高标号分别为A11：9.32 mg/L，A2：39.02 mg/L，A3：58.16 mg/L，A4：78.56 mg/L；刺葡萄酒标号为B1：29.02 mg/L，B2=29.02 mg/L，B3：48.16 mg/L，B4：66.78 mg/L。

1.2.2 酒样褐变程度的测定

以波长420 nm下的吸光值表示葡萄酒的褐变程度。酒样在测定前经过0.45 μm有机相针式过滤，用柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释10倍。光程1 cm的石英比色皿中利用紫外-可见光分光光度计测定。柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液的配制：将75 mL 0.05 mol/L的柠檬酸与25 mL 0.1 mol/L的磷酸钠进行混合，每次现配现用，使用前经过0.45 μm有机相针式过滤。

1.2.3 酒样理化指标的检测

游离SO2、酒度、挥发酸、总酸、还原糖、pH的测定，参照王华《葡萄酒分析检验》[17]。

ORP测定：自动氧化还原电位测定仪测定。

1.3 数据处理方法

所有试验数据均采用数据处理软件DPS(V 7.05)进行处理。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒加速氧化过程中游离SO2含量的变化

在葡萄酒的加速氧化过程中，SO2逐渐被消耗，在氧化的第1天，2种葡萄酒的游离SO2迅速下降，桂葡1号葡萄酒4个处理的游离SO2分别下降了27.01%、49.26%、55.56%和50.47%；刺葡萄酒中4个处理的游离SO2分别下降了51.27%、49.17%、62.58%和58.36%。到加速氧化的第7天，2种葡萄酒所有处理的游离SO2都降低到5.22 mg/L以下，之后，基本维持在3.92 mg/L的状态，虽然游离SO2不能完全被消耗掉，但已经很难表现出抗氧化作用(图1，2)。实验结果表明，即使葡萄酒中含有较高浓度的游离SO2，在较高的温度(40 ℃)、罐内空气残留较多的情况下，仍然会被快速氧化消耗。

图1 桂葡1号葡萄酒氧化过程中游离SO2的变化
Fig.1 Changes of free sulfur dioxide during the oxidation
of Guipu-1 wine

图2 刺葡萄酒氧化褐变过程中游离SO2的变化
Fig.2 Changes of free sulfur dioxide during the oxidation
of brier wine

2.2 游离SO2含量对葡萄酒氧化褐变的影响

在加速氧化的前21 d，不同硫含量的桂葡1号葡萄酒的氧化褐变程度均显著快速增加，褐色素大量形成；21 d之后，变化趋于平缓，有少量下降趋势，表明褐色素形成变缓或下降(图3)。在加速氧化的0～7 d，各处理褐变程度与氧化时间成正相关(P<0.05)，线性斜率分别为：KA1=0.014 5>KA2=0.013 5>KA3=0.014 0>KA4=0.010 3，表明起始游离SO2含量越高，其氧化褐变的程度越低。各处理间在0～7 d褐变程度的差异达到极显著水平(P<0.01)，14 d之后各处理的游离SO2含量维持在3.92 mg/L，各处理间褐变程度差异不显著(P>0.05)。刺葡萄酒在整个氧化过程中，其褐变程度一直呈上升趋势，也符合起始游离SO2含量越高氧化褐变的程度越低的规律(图4)。试验结果表明，葡萄酒中起始游离SO2越高，其氧化褐变程度越低；当葡萄酒中游离SO2含量较低时(3.92 mg/L)，其抗氧化作用基本消失。因此，在葡萄酒的加工中，仅仅靠添加SO2，而没有综合考虑隔氧、低温贮藏等有效手段，仍然避免不了葡萄酒被过度氧化褐变的现象发生。

图3 不同硫含量的桂葡1号葡萄酒的氧化褐变
Fig.3 Oxidative browning of Guipu-1 wine with different sulfur content

图4 不同硫含量的刺葡萄酒的氧化褐变
Fig.4 Oxidative browning of brier wine with different sulfur content

2.3 葡萄酒氧化褐变过程中ORP的变化及与游离SO2的关系

葡萄酒在正常的游离SO2含量(20～50 mg/L)情况下，其ORP在330～390 mV范围内，在葡萄酒加速氧化过程中，2种葡萄酒的ORP在7 d前快速增加，所有处理的ORP均上升到450 mV左右。ORP快速上升可能有2个方面的原因：一是能降低葡萄酒ORP的游离SO2迅速被消耗，二是葡萄酒中的酚类物质被氧化为邻醌，并伴随H2O2的生成，ORP表现为快速上升。在7 d后，2种葡萄酒的ORP保持较为稳定的高水平，因为葡萄酒中的酚类物质减少，自由基生成减弱或消失，氧化反应减退，ORP变化缓和。到氧化的后期，随着氧化的进行，聚合物越来越大，一些褐色素会沉淀下来，褐变程度略微下降(图5，6)。

图5 桂葡1号葡萄酒的氧化褐变过程中ORP的变化
Fig.5 Changes of ORP during oxidative browning of
Guipu-1 wine

图6 刺葡萄酒的氧化褐变过程中ORP的变化
Fig.6 Changes of ORP during oxidative browning of brier wine

在较高游离SO2存在的情况下，同一种葡萄酒游离SO2含量是影响葡萄酒ORP的主要因素。在加速氧化过程中，不同游离SO2含量的桂葡1号葡萄酒和刺葡萄酒的游离SO2与ORP均呈极显著的负相关关系(P<0.01)：不同起始游离SO2的桂葡1号葡萄酒，其游离SO2(Y)与ORP(X)回归方程分别为：YA1=81.663-0.168XA1(R=0.947 5)，YA2=126.154-0.270XA2(R=0.947)，YA3=159.779-0.347XA3(R=0.926)，YA4=190.792-0.422XA4(R=0.923)；刺葡萄酒二者之间的回归方程分别为：YB1=36.425-0.071XB1(R=0.876)，YB2=88.129-0.182XB2(R=0.978)，YB3=99.420-0.209XB3(R=0.913)，YB4=122.036-0.261 1XB4(R=0.957)。葡萄酒的品种和起始游离SO2含量不同，其游离SO2含量与ORP的回归方程各不相同，但其相关性的趋势是一致的。试验结果表明葡萄酒的ORP的变化可以间接反映出游离SO2含量的变化，因此，可以通过监测葡萄酒中ORP含量来预警葡萄酒的氧化褐变程度。

3 结论与讨论

本试验在250 mL玻璃瓶中装入200 mL的酒样并密闭，试验开始的时候，瓶中含有丰富的氧，因此虽然有一定浓度的游离SO2存在，但葡萄酒仍然被急速氧化。有研究表明，在规定SO2添加量的前提下，葡萄酒中的某些酚类物质比SO2吸收及消耗氧更快，SO2的抗氧化作用是与氧化的中间产物邻醌和H2O2的反应[18-20]。因此在加速氧化的前期(前7 d)，桂葡1号葡萄酒和刺葡萄酒的SO2都迅速下降，其褐变程度快速上升，但起始游离SO2含量较高的处理，其抗氧化能力越强，葡萄酒的褐变程度越小。7 d之后，游离SO2的含量一直保持较低的水平，虽然其含量不会被完全消耗掉，但已经很难表现出抗氧化的能力，此时葡萄酒中的可被氧化的物质较少，葡萄酒的氧化褐变程度变化也较小。研究结果表明SO2虽然对葡萄酒具有较好的抗氧化作用，但葡萄酒在高温(40 ℃)和高氧(非满罐贮藏)的情况下，仍然避免不了被氧化损失。因此，在葡萄酒的加工及贮藏期间，保持适宜的游离SO2含量(通常为20 ～40 mg/L)并结合低温和隔氧贮藏是防治葡萄酒被过度氧化的关键措施。

在葡萄酒中存在多种氧化还原电对，构成复杂的氧化还原体系，而其ORP是多种氧化物质与还原物质发生氧化还原反应的综合结果[21-22]。作为能够反映葡萄酒中氧化还原能力的综合性指标，ORP的变化，有助于了解葡萄酒的电化学性质，分析葡萄酒的氧化进程。影响葡萄酒的ORP的因素较多，包括游离SO2、pH值、离子、温度、酒的品种等等[23-24]。本研究结果表明，在南方山葡萄酒加速氧化过程中，其ORP在前期急速增加，后期趋于缓和，其变化与酒中游离SO2的含量密切相关。对起始游离SO2含量不同的葡萄酒在加速氧化过程中ORP与游离SO2的变化分析表明，游离SO2含量与ORP呈显著的负相关关系。因影响葡萄酒的ORP的因素较多，在进行葡萄酒游离SO2和ORP相关研究时，要考虑酒的品种及初始添加的游离SO2含量，在同一品种同一批产品贮藏时，事先建立二者之间的回归方程，然后通过葡萄酒中ORP的变化实时监测游离SO2的变化和葡萄酒的氧化程度。葡萄酒在正常的游离SO2含量情况下，其ORP为330～390 mV，如其含量快速上升，预示其有被氧化的风险，若上升至450～460 mV，则可以确定该葡萄酒中游离SO2含量较低，葡萄酒已经被过度氧化。ORP的检测方便快捷，并能实现在线监测，因此，深入研究葡萄酒中游离SO2的含量与ORP之间的关系，明确其影响因素，对于利用ORP来快速监测葡萄酒中游离SO2含量(或范围值)，减少葡萄酒中过度添加SO2，实现葡萄酒数字化、智能化加工，并对葡萄酒的过度氧化的有效预警有着重要的研究意义。