基于电子鼻和顶空固相微萃取-气相质谱联用技术分析柠檬草中的挥发性成分

2019-03-01陈静慧石浩张强马奕瑜王洪新

食品与发酵工业 2019年3期

陈静慧，石浩，张强，马奕瑜，王洪新

(江南大学食品学院，江苏无锡，214122)

柠檬草(Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf)，又名香茅，是一种生长于热带地区的多年生草本药材，具有柠檬挥发性，既可入药，也可食用，常以香料形式出现于越南、泰国等东南亚菜品中。在巴西，煎煮口服柠檬草是一种民间药方。柠檬草性温，味辛、甘，具有祛风通络、温中止痛、止泻的功效，可用于治疗风寒湿痹、脘腹冷痛、泄泻、跌打损伤，以及由感冒引起的头身疼痛等，其挥发性还具有安神、镇静、助眠的功效[1]。

通过水蒸气蒸馏法得到柠檬草精油是目前柠檬草的主要应用。近期研究发现，柠檬草精油具有抗菌、防腐、抗氧化、祛风、镇痛、助眠、抗抑郁、健胃、促消化的功效[2-5]。柠檬草标志性成分有橙花醛、香叶醛、柠檬烯、香茅醛及香叶醇等[6]，据《巴西药典》，柠檬草精油中至少含有60%的柠檬醛(由互为顺反结构的橙花醛和香叶醛组成)。杨欣等[3]将柠檬草精油与合成抗氧化剂没食子酸丙酯(propionate gallate, PG)从总体抗氧化能力、清除羟基自由基能力、清除超氧阴离子自由基能力等3个方面做比较，实验结果表明，在一定浓度范围内，柠檬草的总抗氧化能力及清除羟基自由基能力高于PG；清除超氧阴离子自由基能力高于PG。李楠[7]以猪油为介质，以过氧化值为指标考察了柠檬草精油对油脂过氧化的抑制能力，研究发现，柠檬草精油在猪油中的抗氧化性与丁基羟基甲苯(butyl hydroxytoluene, BHT)相近。吴慧清等[8]发现，柠檬草精油对大肠杆菌(Escherichiacoli)8099、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538、枯草杆菌黑色变种(Bacillussubtilis)ATCC9372、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC 1 023 1和黑曲霉(Aspergillusniger)ATCCl6404具有显著的抑菌效果。陈佳龄等[9]发现，柠檬草水提液具有较强的羟自由基清除能力，且该能力与样品浓度呈正相关。陈丽芬等[10]发现，柠檬草水提物可以抵抗由高血糖引起的小鼠体质量的下降。

电子鼻(E-nose)气味指纹分析技术是将物质挥发成分的整体信息即“指纹数据”得到的信号与数据库中的信号作出比较和判断，从而得出样品气味的综合判断结果，常用于不同挥发性物质中组成成分的区别判定[11-12]。该技术可以在短时间内迅速分析、判别样品中的挥发性成分，目前已经应用于食品加工工艺的优化和风味品质的监控，用于判别赤霞珠葡萄酒、梨果醋、不同烘烤程度咖啡及不同品种苹果中挥发性成分的差异[12-14]。顶空固相微萃取-气相质谱联用技术(head-space solid phase micro-extraction followed by gas chromatography-mass specteometry，HS-SPME-GC-MS)是目前对挥发性样品中成分进行定性分析的重要手段，具有操作简单、进样快、分析迅速、选择性好、重复性高等优点，整个分析过程集采样、吸附、萃取、浓缩、进样、分析于一体[14-16]。该技术可以对不同蜡梅属植物叶片、贯叶连翘叶及大曲发酵过程中挥发性成分进行快速比较和定性分析[17-20]。

目前对于柠檬草的研究主要集中于对其精油中成分及功效的研究，而对柠檬草作为代茶及香料食用时成分组成的研究很少。柠檬草精油主要应用于化妆品及按摩用油，且提炼精油耗时长、温度高，操作过程难以日常化。加热回流、煮沸及沸水冲泡柠檬草，操作简单，用时少且便于日常化。电子鼻结合HS-SPME-GC-MS技术目前已经成为对挥发性成分及挥发性物质组成进行精确定性、定量分析有效手段[21-24]。本文拟采用电子鼻结合HS-SPME-GC-MS技术比较及分析作为代茶饮用的柠檬草与柠檬草精油的主要挥发性物质成分间异同，从而为柠檬草的实际应用、鉴别及生产加工中质量控制提供理论依据和有效方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料:柠檬草干叶，购于欧尚超市；柠檬草精油，购于阿拉丁试剂网；实验用去离子水。

1.2 仪器与设备

电子分析天平(AR224CN)，奥豪斯仪器(上海)有限公司；400Y多功能粉碎机，铂欧五金厂；HH-4数显搅拌水浴锅，常州赛普实验仪器厂；美的电磁炉；TSQ Quantum XLS三重四级杆气质联用仪，美国赛默飞世尔科技公司；Heracles II快速气相电子鼻，法国Alpha MOS S.A.有限公司

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理方法

处理组A采用加热回流：将干净柠檬草干叶粉碎、过筛，准确称取5 g于250 mL圆底烧瓶中，以料液比1∶15(g∶mL)加入75 mL去离子水，95 ℃加热回流30 min;处理组B采用煮沸法：精确称取5 g粉碎、过筛后的柠檬草干叶，75 mL去离子水浸泡1 h后煮沸5 min;处理组C采用沸水冲泡：另取5 g精确称量的柠檬草粉碎叶用75 mL沸水冲泡,待样品处理完成后，过300目筛收集滤液，分别取3 mL滤液及柠檬草精油(标记为样品D)移入20 mL顶空进样瓶，每组取5个平行样品，4 ℃保存，备用。

1.3.2 电子鼻检测

以空气为空白样品;进样量4 000 μL;孵化温度70 ℃,前加热35 s,初始箱温50 ℃,初始等温线80 ℃时，保持2 s,然后以3.0 ℃/s升温到250 ℃,持续21 s;注射速度125 μL/s;注射器温度200 ℃;注射时间37 s;捕获温度50 ℃,捕获持续时间42 s;分流10 mL/min;恒定流速75.8 mL/min;初始压力80 kPa,升压速度1.67 kPa/s,最终压力180 kPa;采集时间110 s,采集周期0.01 s;2个火焰离子检测器温度均为260 ℃。

表1 电子鼻传感器信息Table 1 Information of E-nose sensor

1.3.3 HS-SPME-GC-MS检测

(1)顶空固相微萃取:采用二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(50/30 μm,DVB/CAR/PDMS)固相微萃取头，萃取前应先对萃取头进行老化，250 ℃老化30 min。

(2)气相质谱条件:采用HP-5 MS石英弹性毛细管柱(0.2 5 μm×250 μm×30.0 m)起始温度50 ℃,无保留，每分钟升温5 ℃到240 ℃持续5 min。进样压力70 kPa,气液流速20 mL/min，气液时间2 min，质谱传输线温度230 ℃，萃取深度40 mm，穿透速度40 mm/s。解析时间5 min，载气为氦气，载气流速1.0 mL/min，不分流进样，清洗流速50 mL/min；质量扫描范围(m/z) 30～500;电子电离源；电子能量70 eV。

1.4 数据分析方法

电子鼻数据的PCA、DFA分析由仪器自带AlphaSoft V12.0及SPSS 20.0、Excel软件进行处理，SPME-GC-MS检测重复3次，结果通过仪器分析及对比NIST11、Wiley275谱图进行检索，并结合相关文献进行定性分析。各组分含量百分数采用峰面积归一化法进行分析。

SPME-GC-MS保留指数(kovats index，KI)的计算：

(1)

2 结果与分析

2.1 基于电子鼻的成分分析

从图1可知，第1主成分PC1(83.571%)与第2主成分PC2(9.106%)贡献率之和在92%以上,表明可以用这2个主成分对通过不同提取方法得到的柠檬草提取物的挥发性成分进行概括分析。区分指数(discrimination index，DI)最大值为100，其值越大表明不同组数据之间区分度越好，一般≥80表示能够有效区分[22]。本次实验PCA图显示电子鼻区分指数为74(<80)，表示电子鼻不可以对不同样品中的挥发性成分进行有效区分，即各组间差异小。进一步观察图1发现，不同样品间的差异可以通过PCA图上的距离表征，图1中直线距离的长短表征差异性的大小，柠檬草精油(D)与浸泡后煮沸的柠檬草叶(B)差异主要体现在第二主成分轴上。沸水冲泡处理的柠檬草叶(C)与柠檬草精油(D)间第一主成分间差异小。而95 ℃回流30 min处理的柠檬草叶(A)与柠檬草精油(D)之间的差异主要体现在第二主成分轴上。

A-通过加热回流得到的样品；B-通过煮沸得到的样品；C-沸水冲泡得到的样品；D-柠檬草精油，下同图1 不同提取方法处理后的柠檬草挥发性成分PCA图Fig.1 Principal component analysis of volatilecomponents of Cymbopogon citratus obtained by differentextracting methods

从图2雷达图中可以看出，不同样品气味指纹图谱基本相似，主要区别是含量的不同，在同一传感器上相同保留时间内成分的差异主要是量的差异。沸水冲泡得到的柠檬草水提物(C)中挥发性成分与柠檬草精油(D)最为接近。

图2 不同提取方法处理后的柠檬草挥发性
成分雷达图
Fig.2 Radar of volatile components ofCymbopogon
citratusobtained by different extracting methods

图3 DFA分析是在PCA分析数据基础上扩大组间差距，缩小组内差距，以更加直观的形式体现不同样品间差异的分析方法。在图3中，第一判别因子(DF1)与第二判别因子(DF2)累计贡献率达到93%以上。DFA分析进一步验证了PCA与雷达分析得出的结论。

图3 不同提取方法处理后的柠檬草挥发性成分DFA图
Fig.3 Dscriminate factorial analysis of volatile
components ofCymbopogoncitratusobtained by
different extracting methods

2.2 基于HS-SPME-GC-MS的成分分析

对HS-SPME-GS-MC分析检测得到的数据进行分析(表2)，采用峰面积归一化法确定挥发性物质的相对含量百分数。结合NIST11谱库、Wiley275质谱工作站进行比较检索，并结合相关文献[2,25-27]，共分析得到24种挥发性化合物，分别为橙花醛、香叶醛、香叶醇、乙酸香叶酯、月桂烯、橙花醇、橙花叔醇、香叶酸、β-蒎烯、乙酸橙花酯、芳樟醇、苯乙酸香叶酯、香芹醇、β-石竹烯、甲酸香叶酯、左旋柠檬烯、对位-2-薄荷烯、香茅醇、甲基庚烯酮、马鞭草烯醇、三氢顺式α-古巴烯、石竹烯氧化物、棕榈酸、松油醇。

表2 柠檬草中主要挥发性成分Table 2 Major volatile components of Cymbopogon citratus

注：“—”表示未检出，本实验数据为重复3次实验后取平均值所得，误差<1%。表中A、B、C、D分别代表4种不同处理方法得到的的样品，其中A代表经95 ℃加热回流30 min处理后的样品，B代表浸泡1 h后煮沸5 min的样品，C代表直接沸水冲泡得到的样品，D代表柠檬草精油。

通过对比4组样品中主要挥发性物质的种类、含量及进一步观察气相质谱丰度与保留时间图(图4、图5)后发现，通过沸水冲泡得到的柠檬草水提物中的主要挥发性成分与柠檬草精油中的主要挥发性物质较为接近，该结果与电子鼻PCA及雷达图分析的结果一致，通过不同提取方法得到的柠檬草水提物气味指纹图谱相似，即含有较多相同物质。而柠檬草精油中各主成分的含量与文献[28-30]中报道的有差异，这可能是由品种、产地、气候条件及处理方法的不同引起的[31]。

3 结论

本研究证明，沸水冲泡后的柠檬草中主要挥发性成分与柠檬草精油最为接近，即柠檬草日常茶饮获得的物质与柠檬草精油中活性物质大部分重叠，茶汤中挥发性成分与柠檬草精油中挥发性成分基本相似。本次研究还发现，电子鼻结合HS-SPME-GS-MC技术可以清晰、有选择性、高效地分析、检测柠檬草中的挥发性物质。电子鼻结合顶空固相微萃取联合气相质谱技术可以判别柠檬草中主要挥发性成分的差异并对柠檬草水提物中的挥发性成分进行定性定量分析，从而为柠檬草的分析、质量判定及应用提供基础数据。