KIM-1在TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞纤维化因子表达中的作用

刘波 王萍 李霞 张杰 李丽

(1兖矿集团有限公司总医院肾内科，山东 邹城 273517；2济宁医学院附属医院肾内科)

肥胖、糖尿病、高血压等均会引起慢性肾脏疾病发生，肾小管间质纤维化是慢性肾脏疾病发展到终末期的共同特征，肾间质纤维化的发生与肾小管上皮细胞上皮间质转化(EMT)有关，在此过程中，上皮细胞标志特征逐渐消失，细胞开始表达α-平滑肌肌动蛋白(SMA)〔1，2〕。肾小管上皮细胞纤维化发生的诱导因素有很多，其中转化生长因子(TGF)-β1是重要的诱发因子，也是常用的体外研究肾小管上皮细胞纤维化的诱导因子〔3〕。肾脏损伤因子(KIM)-1是一种跨膜蛋白，可以反映肾功能的变化，在肾损伤中具有重要意义〔4，5〕。研究显示，KIM-1在肾纤维化组织中表达上调，并且可以用于判断肾功能的损伤情况〔6〕。本实验探讨KIM-1在TGF-β1诱导肾小管上皮细胞纤维化和EMT中的作用。

1 材料与方法

1.1主要材料 大鼠肾小管上皮细胞NRK52E购自成都正能生物；TGF-β1购自美国Pepreotech；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen；BCA蛋白检测试剂盒电化学发光(ECL)试剂盒购自美国Pierce；辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白(Ig)G购自美国Jackson；上皮钙黏附素(E-cadherin)抗体、α-SMA抗体购自美国BD；结缔组织生长因子(CTGF)抗体、1型胶原酶(Col1)抗体、3型胶原酶(Col3)抗体购自美国Abcam；荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物。

1.2细胞培养和分组 大鼠肾小管上皮细胞NRK52E培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中，在37℃，5% CO2培养箱内培养。NRK52E细胞分为：对照组、对照组+TGF-β1、阴性组+TGF-β1、干扰组+TGF-β1，对照组+TGF-β1、阴性组+TGF-β1、干扰组+TGF-β1细胞分别用TGF-β1刺激，刺激方法为：在细胞培养液中添加10 ng/ml的TGF-β1继续孵育72 h。阴性组+TGF-β1、干扰组+TGF-β1细胞在TGF-β1刺激前，分别转染siRNA对照和KIM-1 siRNA，细胞转染用脂质体转染法，具体步骤同Lipofectamine 2000转染试剂说明书。

1.3qRT-PCR法检测 TGF-β1刺激后的肾小管上皮细胞中KIM-1的表达水平 对照组、对照组+TGF-β1细胞处理方法同上，提取细胞的RNA，步骤简述如下：在细胞中添加TRIZOL，用移液枪反复吹打混合后，转移到离心管中，以低温4℃，离心10 min，弃上清，加入三氯甲烷，上下颠倒混合后，置于冰上孵育15 min，低温4℃，离心10 min，吸取上清溶液，与异丙醇混合沉淀RNA，乙醇洗涤，用DEPC水溶解。取RNA，在72℃变性约10 min后，42℃孵育60 min，95℃孵育5 min，逆转录合成cDNA。取cDNA，用荧光定量PCR测定计算KIM-1 mRNA水平，步骤同荧光定量PCR试剂盒。

1.4Western印迹法检测TGF-β1刺激后的肾小管上皮细胞中KIM-1的表达水平 对照组、对照组+TGF-β1细胞处理方法同上，用PBS洗涤3次以后，在细胞中添加细胞裂解液，在冰上裂解30 min后，置于低温4℃离心10 min，吸取上清，保存在-80℃。用BCA法检测蛋白浓度。取蛋白样品，以每个泳道添加30 μg蛋白样品进行蛋白电泳，电泳用10%的分离胶、5%的浓缩胶。上样前，把蛋白样品与上样缓冲液在100℃孵育5 min。用转膜仪把蛋白转移到PVDF膜上，电流调整为350 mA。用5%脱脂奶粉封闭后，再分别与一抗和二抗反应，一抗以1∶600稀释，二抗以1∶2 000稀释。ECL显色，Alpha-view对蛋白进行定量分析。

1.5Western印迹检测细胞中EMT标志蛋白E-cadherin、α-SMA和纤维化因子CTGF、Col1、Col3的表达 对照组、对照组+TGF-β1、阴性组+TGF-β1、干扰组+TGF-β1细胞处理方法同上，用Western印迹法检测细胞中EMT标志蛋白E-cadherin、α-SMA和纤维化因子CTGF、Col1、Col3的表达，E-cadherin、α-SMA一抗以1∶800稀释，CTGF、Col1、Col3一抗以1∶1 000稀释。步骤同上。

1.6统计分析 应用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1KIM-1在TGF-β1作用后的肾小管上皮细胞中表达上调 对照组+TGF-β1细胞中KIM-1蛋白和mRNA水平均显著高于对照组(P<0.05)。TGF-β1诱导肾小管上皮细胞表达KIM-1。见图1、表1。

图1 Western印迹检测KIM-1在TGF-β1作用后的肾小管上皮细胞中的表达

组别KIM-1 mRNAKIM-1蛋白对照组1.00±0.000.28±0.02对照组+TGF-β14.36±0.241)0.97±0.051)

与对照组比较：1)P<0.05

2.2转染KIM-1 siRNA后的肾小管上皮细胞中KIM-1蛋白和mRNA水平表达下调 干扰组+TGF-β1细胞中KIM-1蛋白和mRNA水平较对照组+TGF-β1显著降低(P<0.05)。阴性组+TGF-β1细胞中KIM-1蛋白和mRNA水平与对照组+TGF-β1比较差异无统计学意义(P>0.05)。KIM-1 siRNA成功下调了肾小管上皮细胞中KIM-1的表达和转录。见图2、表2。

图2 Western印迹测定转染KIM-1 siRNA后的肾小管上皮细胞中KIM-1蛋白表达

组别KIM-1 mRNAKIM-1蛋白对照组+TGF-β11.00±0.000.93±0.11阴性组+TGF-β10.98±0.130.95±0.14干扰组+TGF-β10.41±0.061)0.36±0.051)

与对照组+TGF-β1比较：1)P<0.05

2.3下调KIM-1抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT 与对照组比较，对照组+TGF-β1细胞中E-cadherin蛋白表达显著下调，α-SMA蛋白表达显著升高(P<0.05)。与对照组+TGF-β1比较，干扰组+TGF-β1细胞中E-cadherin蛋白水平显著升高，α-SMA蛋白水平显著降低(P<0.05)。阴性组+TGF-β1细胞中E-cadherin、α-SMA蛋白与对照组+TGF-β1比较，差异无统计学意义(P>0.05)。TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT，而下调KIM-1可以减弱TGF-β1对肾小管上皮细胞EMT的诱导作用。见图3、表3。

组别E-cadherinα-SMA对照组0.83±0.090.25±0.04对照组+TGF-β10.48±0.071)0.75±0.091)阴性组+TGF-β10.46±0.080.73±0.05干扰组+TGF-β10.67±0.072)0.60±0.052)

与对照组比较：1)P<0.05；与对照组+TGF-β1比较：2)P<0.05，下表同

2.4下调KIM-1抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞表达纤维化因子CTGF、Col1、Col3 与对照组比较，对照组+TGF-β1细胞中CTGF、Col1、Col3蛋白表达显著升高(P<0.05)。与对照组+TGF-β1比较，干扰组+TGF-β1细胞中CTGF、Col1、Col3蛋白水平显著降低(P<0.05)。阴性组+TGF-β1细胞中CTGF、Col1、Col3蛋白与对照组+TGF-β1比较，差异无统计学意义(P>0.05)。TGF-β1诱导肾小管上皮细胞表达纤维化因子CTGF、Col1、Col3，而下调KIM-1可以减弱TGF-β1对肾小管上皮细胞表达CTGF、Col1、Col3的诱导作用。见表4、图4。

图4 Western印迹检测下调KIM-1后的肾小管上皮细胞纤维化因子的表达

组别CTGFCol1Col3对照组0.35±0.030.25±0.020.12±0.03对照组+TGF-β10.69±0.051)0.52±0.061)0.28±0.021)阴性组+TGF-β10.68±0.090.53±0.080.29±0.04干扰组+TGF-β10.46±0.052)0.40±0.042)0.19±0.032)

3 讨 论

KIM-1蛋白含有一个6个半胱氨酸构成的球蛋白和黏液素的功能区域连接而成的结构域，在正常的肾脏组织中表达水平极低，在损伤后的肾组织中异常升高〔7，8〕。KIM-1水平与患者肾组织损伤程度的诊断、预后等有关〔9〕。KIM-1可以诱导急性肾损伤大鼠肾小管上皮细胞发挥清除组织碎片的作用，而清除组织碎片有利于肾小管重构，KIM-1是急性肾损伤发生后炎症反应的关键环节〔10，11〕。同样在慢性肾损伤中发现，KIM-1表达明显的区域肾小管损伤严重，肾纤维化程度高，KIM-1与慢性肾脏疾病有关〔12，13〕。研究显示，TGF-β1刺激后的肾小管上皮细胞中KIM-1表达水平升高，KIM-1可能参与肾小管上皮细胞纤维化的发生〔14〕。本实验的结果显示，TGF-β1处理以后的肾小管上皮细胞中KIM-1的转录和表达水平均升高，这与上述报道相符合。上皮细胞黏附在基底膜上，是一种极性细胞，其侧面可以与邻近的上皮细胞相互作用，形成类似于铺路石样的形态，而间充质细胞可以分化为多种不同的间质细胞，在胚胎的发育中具有重要作用〔15〕。EMT主要表现为上皮细胞形态特征减弱，逐渐与基底膜分离，并获得间质细胞的标志，在心肌纤维化、肾组织纤维化、癌症转移等疾病的发生中有重要作用〔16〕。肾小管上皮细胞EMT的发生与肾组织的损伤有关，如肾小球肾炎、高血压、糖尿病肾病等，研究表明，在不同原因引起的肾组织损伤中均发现有不同程度的肾小管EMT，并且EMT发生水平不仅与血肌酐水平等相关，还与肾纤维化的程度及预后有关〔17〕。本实验结果显示，TGF-β1处理后的肾小管上皮细胞EMT水平升高，而敲低KIM-1可以抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT，提示KIM-1在肾小管上皮细胞转分化中具有重要作用。

肾组织纤维化与细胞分泌的多种纤维化因子的表达有关，CTGF是由349个氨基酸组成的多肽，属于一种生长因子，参与细胞外基质、细胞黏附、有丝分裂等过程，在肾纤维化中发挥促进作用，在多种原因引起的肾损伤中表达上调〔18〕。Col1、Col3过度表达是肾纤维化发生的重要原因，其表达水平升高后可以促进肾小管上皮细胞纤维化〔19〕。研究表明，TGF-β1作为一种重要的肾纤维化诱发因子，可以促进肾小管上皮细胞中Col1、Col3、CTGF的表达〔20〕。本实验结果表明，敲低KIM-1可以抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞表达Col1、Col3、CTGF，敲低KIM-1具有抑制肾小管上皮细胞纤维化的作用。

KIM-1在肾纤维化中表达上调，在TGF-β1诱导肾小管上皮细胞纤维化中表达升高，敲低KIM-1的表达水平可以抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT和表达纤维化因子，KIM-1可能是一个潜在的干预肾间质纤维化的靶点。