功能验证P62基因在胰腺癌转移过程中的作用

田文嘉 林香春

(北京大学国际医院，北京 102206)

胰腺癌是消化道系统预后最差的恶性肿瘤之一，在癌症相关死亡中位列第四〔1〕，而转移是胰腺癌患者死亡的主要原因之一〔2〕。胰腺癌的发生、发展和转移是一个多基因、多信号通路参与的复杂的生物过程〔3〕。因此，发现和验证与胰腺癌转移有因果关系的基因及其分子机制对胰腺癌的诊断和治疗有重要意义。本实验在结合前期全基因组基因突变技术筛选得到的P62基因的基础上，利用小干扰RNA(siRNA)、Werstern印迹、细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)等方法，进一步探讨P62基因在胰腺癌转移过程中的作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂 人胰腺癌AsPC-1来自北京协和医学院基础医学研究所。胎牛血清(FBS)购自美国NQBB公司，DMEM培养基购自美国HyClone公司，LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，TRIzol试剂、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司，抗P62单克隆抗体购自Cell Signalling公司。

1.2细胞培养 AsPC-1细胞培养采用DMEM高糖培养基，加入10% FBS，将AsPC-1细胞放于含有5%CO2的37℃恒温孵箱中，待细胞生长至对数生长期。

1.3总RNA的提取和荧光定量PCR 用TRIzol法提取细胞总RNA，用反转录试剂合成cDNA。以此cDNA为模板用荧光定量PCR试剂盒检测P62 mRNA的表达情况。荧光定量PCR引物由广州天一辉远基因科技有限公司合成，P62上游引物序列为5′-CUUGCGUAGAAUUGCAGGUTT-3′，下游引物序列为5′-ACCUGCAAUUCUACGCAAGTT-3′。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游引物序列为5′-TCTGACTTCAACAGCGACAC-3′，下游引物序列为5′-CAAATTCGTTGTCATACCAG-3′。荧光定量PCR条件：95℃ 10 min；94℃ 30 s，94℃ 5 s，60℃ 10 s，40个循环。实验重复3次。

1.4蛋白质印迹法 细胞用放射免疫沉淀法裂解液(RIPA)裂解提取蛋白质后用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白质浓度，10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离蛋白质后转移至硝酸纤维素膜，然后用兔抗人P62(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)孵育过夜。羊抗兔二抗(1∶10 000)孵育1 h。蛋白质表达水平用电化学发光显色试剂盒检测。

1.5细胞转染 实验分为阴性对照(NC)组和P62 siRNA干扰(si-P62)组，将培养至对数生长期的AsPC-1种植于6孔板中，待细胞密度生长至70%左右时，按照说明书的操作，分别将等量的NC及P62特异性siRNA转染至两组细胞中,细胞培养4 h后，换液继续培养细胞。

1.6CCK-8实验 将培养至对数生长期的AsPC-1细胞清洗、消化，制备成细胞悬液，根据每孔2 000个细胞的铺板细胞数，将细胞悬液接种到96孔板上，每孔200 μl，每个样本重复6次。分别将等量的NC及P62特异性siRNA转染至两组细胞中，细胞培养4 h后，换液继续培养细胞。在每天同一时间向每孔中加入20 μl CCK-8溶液，在37℃孵箱中孵育3 h，用于检测转染siRNA后的胰腺癌细胞的增殖情况。用酶标仪测定不同时间点(12、24、36、48 h)两组细胞在450nm波长处的光吸收值(A值)，以反映细胞的增殖情况。

1.7统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组P62 mRNA表达情况比较 si-P62组(0.036±0.05)P62 mRNA表达水平明显低于NC组(1.000±0.90,P<0.01)。见图1。

图1 两组P62蛋白表达结果

2.2P62表达对胰腺癌细胞增殖能力的影响 与NC组相比，si-P62组细胞24、36、48 h细胞A值均显著下降(P<0.01，P<0.001)。见表1。

表1 两组12、24、36、48 h细胞增殖能力比较

3 讨 论

近年来，胰腺癌患者的治疗仍然是早期根治性手术切除加术后放疗、化疗，而胰腺癌起病隐匿，早期没有特异性的临床症状和体征，发现时多已处于中、晚期阶段，超过80%的患者由于肿瘤的远处转移而没有机会获得治愈性的手术切除〔4〕，所以胰腺癌的死亡率依然没有明显改善。

自噬的概念是由Ashford等〔5〕在1962年研究肝细胞糖代谢时发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出来的。在正常情况下，自噬能够通过对胞内物质的降解，从而实现自身细胞器的更新。然而，研究发现自噬是一把双刃剑，它在正常细胞中扮演抑制细胞癌变的角色，但在已经发生癌变的细胞中，自噬却能够通过赋予肿瘤细胞抵抗外界不良环境的能力，进而促进肿瘤细胞的增殖和转移〔6〕。研究已经揭示哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、大鼠肉瘤(RAS)-环磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)通路在自噬中起重要的作用〔7〕，但是，对于自噬在肿瘤细胞中具体的分子机制仍不清楚。

本研究选用分化好、恶性程度相对低的AsPC-1人胰腺癌细胞系作为研究对象，在前期采用全基因组随机基因敲除技术平台，筛选得到的能够将低转移性AsPC-1细胞转变为高转移细胞的P62基因的基础上〔8〕，进一步功能验证P62基因在胰腺癌转移过程中的作用，为进一步探讨P62影响胰腺癌转移能力的分子机制提供了理论基础。