广西壮族绝经后妇女雌激素受体-α基因多态性对碱性磷酸酶和骨密度的影响

顾建忠 李海 陈建海 杨洁 方晓燕 黎飚 潘春玲

(右江民族医学院1研究生院，广西 百色 533000；2基础医学院)

社会老年化是全球性难题，近年来中国老年化逐年加快，伴随是老年性疾病日益严重，绝经后骨质疏松(PMOP)也称为Ⅰ型骨质疏松，其发病率最高且临床症状最重。绝经妇女，卵巢功能下降，雌激素分泌减少，引起雌激素减少所致的骨质流失，引起PMOP〔1，2〕。但临床上也发现同是绝经妇女在同样的雌激素水平的情况下，也有不出现骨质疏松的情况。这可能是雌激素受体(ER)的问题〔3，4〕，不同ER基因型是否会影响到雌激素功能的发挥，这与遗传因素有关。本文探讨ER-α基因多态性及不同基因型与骨代谢密切相关的碱性磷酸酶(ALP)和骨密度(BMD)的相关性，寻找PMOP的绝经妇女ER-α基因的易感基因，做好提前防治，减轻这种疾病所致社会和家庭负担。

1 对象和方法

1.1研究对象 广西壮族绝经妇女(祖宗三代为纯广西壮族)，并剔除心肝肾等器官疾病且无骨方面疾病。半年内无服用激素之类对骨代谢有影响的药物。612例广西壮族绝经妇女(40～80岁)。

1.2BMD的检测 使用德国制造骨密度仪(Quantitative Ultrasound Bone Densitometry，QUS)测量受试者右侧跟骨的骨密度(BMD)，超声跟骨BMD仪是目前应用范围最广、受试对象最容易接受无损害设备。由同一特训、熟练的BMD度仪操作人员测定。 生化试剂盒法测定血清ALP水平。

1.3ER基因多态性检测

1.3.1引物设计与合成 引物设计参考有关文献进行〔3〕，上游引物：5′-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3′，下游引物：5′-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3′。扩增样本的ER基因第1内含子及第2外显子，产物为1.3 kb片段。

1.3.2提取DNA模板 用碘化钠法。取100 μl抗凝全血加入双蒸水无菌100 μl，并摇混匀，加NaI (6 mol/L)200 μl震荡30 s，再加等体异戊醇/氯仿(1∶24)震荡30 s，离心分离上清液，在上清液里加异丙醇混(1∶0.6)涡旋混匀，4℃放置15 min，离心并取沉淀物，再用70%乙醇洗涤沉淀物1次，晾干沉淀物并溶于Tris-Hcl+EDTA溶液中，DNA提取物用紫外分光光度计定量，放置-20℃低温冰箱待测。

1.3.3PCR扩增 内含10倍缓冲液200 μmol/L和dNTPs200 μmol/L的反应体系为50 μl，0.4 μmol/L的引物，0.1 μg的模板DNA。把反应体、引物和DNA模板一起置于日本产热循环仪(Bio-Rad型)中，经95℃预变性5 min后加入3 U 的TaqDNA聚合酶。反复32次循环，再94℃变性30 s，61℃退火60 s，再在72℃条件下延伸90 s，最后一次循环后，再经72℃10 min最后延伸。取其10 μl产物经凝胶电泳仪进行电泳，染色(用溴乙啶)后，在紫外灯下检测结果和特异性。

1.3.4酶切扩增物 取限切酶PvuⅡ10 U，限切酶XbaⅠ20 U和扩增产物10 μl共置于37℃酶切3 h。反应最终产物经过2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色30 min，DNA分子量Marker为参考，电泳结果在紫外灯下观察。

1.4统计学处理 应用SSPS18.0软件进行方差分析、t及χ2检验。

2 结 果

2.1ER-α 基因型分析 使用PvuⅡ酶切可区分出3种基因型：PP 型(1.3 kb大小的1条带)；Pp型(1.3 kb，860 bp，460 bp 大小的3条带)，pp型(860 bp，550 bp；460 bp大小的3条带)，见图1。使用XbaⅠ进行酶切可以区分出3个基因型：XX型(1.3 kb大小的1条带)，Xx 型(1.3 kb，900 bp，380 bp大小3条带)，xx 型(900 bp，650，380 bp大小3条带)，见图2。

图1 ER-α基因PvuⅡ多态性电泳图

图2 ER-α基因XbaⅠ多态性电泳图

2.2ER-α基因PvuⅡ多态性与血清ALP测定结果 广西壮族绝经妇女各ER-α基因PvuⅡ酶切基因组的血清ALP水平随着年龄增大逐渐升高，60岁之前的ER-α基因PvuⅡ酶切基因5个基因(PP，pp，Pp，P，p)在同一个年龄组的血清ALP水平无明显差异(P>0.05)，而60岁之后的ER-α基因PvuⅡ酶切基因的P基因在同一年龄组与其他4个基因组(PP，pp，Pp，p)比较，血清ALP水平明显升高(P<0.05)，见表1。

表1 ER-α基因PvuⅡ多态性与ALP测定结果

与其他4个基因同一年龄组比较：1)P<0.05，下表同

2.3ER-α基因PvuⅡ多态性与跟骨超声BMD测定结果 广西壮族绝经妇女各个ER-α基因PvuⅡ酶切基因组的右跟骨BMD随着年龄增大BMD逐渐减小，60岁之前的ER-α基因PvuⅡ酶切基因5个基因各个年龄组的BMD没有明显差异(P>0.05)，而60岁之后的ER-α基因PvuⅡ酶切基因的P基因与同一年龄组其他4个基因组比较，BMD明显降低(P<0.05)，见表2。

表2 ER-α基因PvuⅡ多态性与BMD测定结果

2.4ER-α基因XbaⅠ多态性与ALP测定结果 广西壮族绝经妇女各个ER-α基因XbaⅠ酶切基因组的血清ALP水平随着年龄增大逐渐升高，65岁之前的ER-α基因XbaⅠ酶切基因5个基因(XX，xx，Xx，X，x)，各个年龄组的ALP水平没有明显差异(P>0.05)，而65岁之后的ER-α基因XbaⅠ酶切基因的Xx基因同一年龄组与其他4个基因组(XX，xx，X，x)比较，ALP水平明显降低(P<0.05)，见表3。

表3 ER-α基因XbaⅠ多态性与ALP测定结果

2.5ER-α基因XbaⅠ多态性与BMD测定结果 广西壮族绝经妇女各ER-α基因XbaⅠ酶切基因组的右跟骨BMD随着年龄增大BMD逐渐减小，65岁之前的ER-α基因XbaⅠ酶切基因，5个基因(XX，xx，Xx，X，x)，各个年龄组的BMD没有明显差异(P>0.05)，而65岁之后的ER-α基因XbaⅠ酶切基因的Xx基因同一年龄组其他4个基因组(XX，xx，X，x)比较，BMD明显提高(P<0.05)，见表4。

表4 ER-α基因XbaⅠ多态性与BMD测定结果

3 讨 论

PMOP是老年性骨质疏松中最常见、临床症状最严重的的一种。研究表明绝经后卵巢功能退化，合成和分泌内源性雌二醇水平下降〔5〕。但有些绝经女性骨质疏松的程度与内源性雌二醇水平下降不呈正比。这可能为ER敏感性问题，导致同一内源性雌二醇水平，表现出不同生理功能效应——骨质流失不同。而基因多态性与家族遗传有关〔6～8〕。

本研究结果说明ER-α的PvuⅡ酶切基因对绝经妇女早期的血清ALP水平和BMD没有明显影响，而绝经晚期ER-α的PvuⅡ酶切的P等位基因妇女的血清ALP水平升高，说明骨代谢功能旺盛，成骨细胞功能下降，破骨细胞功能亢进，骨质流失加快，BMD降低。因为ALP是骨代谢最敏感指标〔9,10〕，所以P等位基因妇女更加容易患PMOP，应该提前防治。

本研究结果表明ER-α的XbaⅠ酶切基因对绝经妇女早期的ALP水平和BMD没有明显影响，而绝经晚期ER-α的XbaⅠ酶切的Xx等位基因妇女的ALP水平降低，说明骨代谢相对正常，成骨细胞功能和破骨细胞功能相对平衡，骨质流失得以抑制，BMD相对较高。Xx等位基因妇女绝经妇女不易患PMOP。

通过普查分析广西壮族妇女绝经ER基因多态性与ALP水平和BMD大小的关系，找出导致ALP水平升高和BMD下降的ER基因，对易感人群提前防治，可以减少PMOP发病或减轻患病程度。