PVT1通过促进肿瘤干细胞特性介导肺腺癌细胞PC9厄洛替尼抵抗

汤中文 倪正义

(武汉市金银潭医院胸外科，湖北 武汉 430023)

2015年我国肺癌新发病例约73.3万，死亡61.0万，且呈快速增长趋势〔1〕，肺腺癌属于非小细胞肺癌，是肺癌主要的病理类型，其细胞恶性程度强，血行转移发生早，多数患者就诊时已处于晚期〔2〕。表皮生长因子受体(EGFR)是影响肺腺癌进展的重要因素，EGFR突变的肺腺癌细胞倾向于更高的恶性程度，同时存在EGFR突变的患者肿瘤进展更快且预后不良〔3〕，表明EGFR可作为原癌基因参与促进肺腺癌的进展。厄洛替尼为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，可显著改善EGFR突变肺腺癌患者病情及预后水平，是目前晚期肺腺癌患者靶向治疗的一线药物之一〔4〕，然而原发及获得性耐药的发生将最终导致厄洛替尼治疗的失败〔5〕。浆细胞瘤转化迁移基因(PVT)1属于长链非编码RNA(LncRNA)，是近年肿瘤研究的热点分子，其可通过多种途径参与促进不同恶性肿瘤的恶性行为〔6〕。本实验以EGFR敏感突变的PC9肺腺癌细胞系为模型，对PVT1与厄洛替尼抵抗的关系及相关机制进行初步探究。

1 材料与方法

1.1实验细胞及试剂 实验细胞包括人肺腺癌细胞系PC9(上海生博生物医药科技有限公司)及人胚肾细胞293T(美国模式培养物集存库)。主要实验试剂包括：科研用盐酸厄洛替尼(美国Selleck公司，货号：S1023)，DMEM高糖培养基及胎牛血清(美国Gibco公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液(上海索宝生物科技有限公司)，嘌呤霉素(美国Sigma公司)，慢病毒包装试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)，慢病毒对照载体、干扰载体siPVT1-1及siPVT1-2(苏州吉玛基因股份有限公司)，TRIzol Reagent RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ核酸荧光染料(大连宝生物工程有限公司)，qPCR引物合成(武汉金开瑞生物工程有限公司)，Ripa蛋白裂解液及BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，蛋白酶抑制剂cocktail(美国Roche公司)，EasyBlot电化学发光(ECL)显色试剂盒(上海生工生物工程公司)，抗体(美国Abcam公司)：CD133(ab19898)，CD44(ab51037)，β-actin(ab8227)，Goat Anti-Rabbit免疫球蛋白(Ig)G二抗(ab6721)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)。

1.2实验仪器 主要实验仪器包括：HeraguardTMECO超净工作台及Forma CO2细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)，DM1000显微镜(德国Leica公司)，1-16K高速离心机(德国Sigma公司)，2720 Thermal Cycler PCR仪及Nanodrop2000超微量分光光度计(美国Thermo Scientific公司)，7500 Fast实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Scientific公司)，iMark多功能酶标仪(美国Bio-Rad公司)，电泳仪及转膜仪等(上海天能科技有限公司)，Gel Imager凝胶成像系统(美国Thermo Scientific公司)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养与分组处理 PC9及293T细胞均使用10%胎牛血清DMEM高糖培养基培养，培养环境：5%CO2，37℃，湿度100%。分组处理：将293T细胞接种至6孔板中，接种浓度为2×105个/孔，共接种3孔，分别标记为对照组、干扰A组及干扰B组病毒，培养过夜后取3支1.5 ml离心管，每管加入7.5 μl转染脂质体及500 μl DMEM高糖培养基，并分别加入慢病毒对照载体、干扰载体siPVT1-1及siPVT1-2，充分混匀后室温静置20 min，分别加入相应的293T细胞中，6 h后更换10%胎牛血清DMEM高糖培养基培养，48 h后收集细胞上清液，过滤后得到3组病毒悬液备用。将PC9细胞接种至6孔板中，接种浓度为2×105个/孔，共接种3孔，同样分别标记为对照组，干扰A组及干扰B组，将各组病毒悬液与10%胎牛血清DMEM高糖培养基1∶1混合培养各组PC9细胞3天，1 μg/ml嘌呤霉素筛选细胞至稳定生长。

1.3.2实时荧光定量PCR(qPCR)检测各组细胞PVT1、CD133和CD44 mRNA表达水平 收集对照组、干扰A组及干扰B组细胞2×105个以上，Trizol法提取细胞总RNA，反转录试剂盒得到3组细胞的cDNA模板，稀释合成引物，引物序列：PVT1上游引物5′-CATCCGGCGCTCAGCT-3′，下游引物5′-TCATGATGGCTGTATGTGCCA-3′；CD133上游引物5′-TTACGGCACTCTTCACCT-3′，下游引物5′-TATTCCACAAGCAGCAAA-3′；CD44上游引物5′-ACAACTGGTGATGGAGACTCATCC-3′，下游引物5′-CAGAGTGGCTTATCATCTTGG-3′；β-actin上游引物5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游引物5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。根据SYBR Premix Ex Taq Ⅱ核酸荧光染料要求配置qPCR体系，行两步法PCR扩增：预变性95℃，30 s；扩增反应95℃，5 s，60℃，34 s，熔解阶段95℃，15 s。以β-actin为内参基因，2-△△CT法计算各组细胞PVT1及CD133、CD44 mRNA的表达量。

1.3.3Western印迹检测各组细胞CD133和CD44 蛋白表达水平 收集对照组、干扰A组及干扰B组细胞5×105个以上，Ripa裂解液冰上裂解细胞2 h，13 000 r/min，4℃离心10 min，取上清液BCA试剂盒检测总蛋白浓度，取50 μg配置十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样体系，100℃变性5 min，10%SDS-PAGE电泳稳压120 V，2 h，转膜稳流300 mA，2 h，5%脱脂牛奶封闭2 h，PBS洗膜后一抗4℃摇转孵育过夜，抗体浓度1∶1 000，PBS洗膜3次，1∶2 000二抗室温孵育2 h，PBS洗膜3次后行ECL发光，Gel Imager凝胶成像系统曝光条带上蛋白印迹，并扫描灰度值，以β-actin为内参基因，目的条带与β-actin灰度值比作为目的蛋白表达量。

1.3.4CCK-8实验检测各组细胞厄洛替尼半抑制浓度(IC50) 接种对照组、干扰A组及干扰B组细胞于96孔板中，浓度2 000个/孔，设置0、2.5、5、10、20、40、80、160、320 nmol/L厄洛替尼浓度梯度，每组浓度梯度设置5个重复孔，培养过夜后加入相应浓度的厄洛替尼继续培养24 h，弃上清，CCK-8试剂与10%胎牛血清DMEM高糖培养基1∶5混合均匀后加入细胞中，37℃孵育1 h，酶标仪检测450 nm处波长，以各组细胞0 nmol/L浓度的吸光值为基线绘制拟合曲线，并分析细胞厄洛替尼IC50值。

1.4统计学方法 采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析、SNK-q法。

2 结 果

2.1各组细胞PVT1、CD133和CD44 mRNA表达水平的比较 对照组、干扰A组及干扰B组细胞PVT1表达水平分别为(0.057±0.006)、(0.016±0.002)及(0.012±0.002)；对照组、干扰A组及干扰B组细胞CD133 mRNA表达水平分别为(0.237±0.019)、(0.095±0.010)及(0.127±0.014)；对照组、干扰A组及干扰B组细胞CD44 mRNA表达水平分别为(0.386±0.033)、(0.179±0.013)及(0.142±0.018)，干扰A组及干扰B组PVT1、CD133和CD44 mRNA的表达水平均显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2各组细胞CD133及CD44蛋白表达水平的比较 对照组、干扰A组及干扰B组细胞CD133 蛋白表达水平分别为(0.691±0.103)、(0.348±0.072)及(0.316±0.085)；对照组、干扰A组及干扰B组细胞CD44 蛋白表达水平分别为(0.540±0.093)、(0.274±0.060)及(0.282±0.057)；干扰A组及干扰B组CD133和CD44 蛋白表达水平均显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 对照组、干扰A组及干扰B组细胞CD133及CD44 蛋白表达水平

2.3各组细胞厄洛替尼IC50的比较 对照组、干扰A组及干扰B组细胞厄洛替尼IC50分别为〔(149.4±15.3)nmol/L〕、〔(53.1±8.2)nmol/L〕及〔(67.4±10.5)nmol/L〕，干扰A组及干扰B组厄洛替尼IC50显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

LncRNA是一类无开放阅读框且转录本长度大于200 nt的RNA分子，其不翻译相应蛋白，而是通过转录调控及转录后调控等表观遗传机制发挥生物学作用〔7〕。基于表观遗传在肿瘤中的重要地位，包括PVT1在内的多种LncRNA被发现参与影响恶性肿瘤的发生发展〔8〕，PVT1基因定位于人染色体8q24上，研究显示其在多种恶性肿瘤组织中表达上调，且可促进肿瘤细胞的恶性行为及化疗抵抗的形成：PVT1被发现高表达于胰腺癌，且表达与患者淋巴结转移及不良预后正相关，PVT1是导致胰腺癌患者预后不良的独立危险因素〔9〕；PVT1在胃癌组织及细胞中表达上调，与患者预后不良正相关，且在多药耐药的胃癌组织及细胞中表达进一步增强，体外研究显示PVT1可促进多药耐药基因、mTOR信号通路及缺氧诱导因子1α的活化介导胃癌细胞的恶性行为〔10〕；PVT1高表达于卵巢癌组织中，且可通过抑制卵巢癌细胞的凋亡介导其顺铂抵抗能力的形成〔11〕；PVT1还可通过调控信号转导与转录激活因子(STAT)6的表达促进乳腺癌细胞的体内外增殖〔12〕；PVT1在结直肠癌组织中表达上调，同样可提示患者预后不良，体外siRNA介导PVT1表达下调后细胞增殖及转移能力均显著下调〔13〕；非小细胞肺癌组织及细胞中同样发现PVT1的高表达，且PVT1表达与细胞组织学分级、淋巴结转移及患者不良预后显著正相关，体外干扰PVT1表达可下调肺癌细胞增殖转移能力，提示PVT1对肺癌细胞恶性行为存在促进作用〔14，15〕，但目前有关PVT1与肺腺癌厄洛替尼抵抗的关系及相关机制尚不明确。肿瘤干细胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的肿瘤细胞，其具有启动和重建肿瘤组织表型的能力，被认为与恶性肿瘤放化疗抵抗的形成密切相关〔16〕，CD133及CD44是经典的非小细胞肺癌干细胞标志物，CD133参与肿瘤信号转导及免疫逃逸等机制，是影响肿瘤细胞生长及生存的重要分子，而CD44则参与细胞间及细胞间质间的特异性粘连，对肿瘤细胞的黏附及上皮间充质转化具有重要意义，两者均被发现参与肺癌细胞放化疗抵抗的形成〔17，18〕。另外，Farhana等〔19〕在研究中指出PVT1与结直肠癌细胞干细胞特性存在密切联系。

本研究结果显示，体外干扰PC9肺腺癌细胞系中PVT1表达后，细胞CD133及CD44的mRNA及蛋白表达均出现明显下调，提示PVT1可能通过CD133及CD44转录水平的正调控作用，促进肺腺癌的干细胞特性。干扰PVT1表达后，细胞厄洛替尼IC50值显著降低，对厄洛替尼的敏感性增强，提示PVT1对PC9细胞厄洛替尼抵抗发生的促进作用。综上所述，本研究表明PVT1可通过介导肺腺癌细胞干细胞特性促进其厄洛替尼抵抗的发生。