过表达miR-136调控E2F1对宫颈癌细胞增殖凋亡的作用及其机制

隋晓宇 孙玉荣 关易彤

(1齐齐哈尔医学院附属第一医院妇科，黑龙江 齐齐哈尔 161041；2齐齐哈尔医学院病理诊断中心)

2015年数据显示，全球每年宫颈癌的新增发病例和死亡病例分别约为50万和28万，其中7/8的新发病例发生在发展中国家〔1，2〕。高危人乳头瘤病毒的持续性感染是宫颈癌发病的明确原因，目前由于宫颈癌临床上筛查方法的局限性，寻找新的筛查生物标志物至关重要。宫颈癌的发生发展是一个多宿主基因共同作用的结果，大量研究显示，宫颈癌细胞中miRNA的异常表达与宫颈癌的发生密切相关〔3～5〕。近年来有研究发现，miR-136在宫颈癌组织中存在异常表达，与宫颈癌预后不良关系密切〔6〕。本研究旨在探讨miR-136对宫颈癌细胞增殖凋亡的影响及可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 miR-136 mimics、mimics control、siRNA-E2F1(E2F1抑制剂)、E2F1 negative control和PCR扩增引物均购于广州锐博生物科技有限公司，人正常上皮293T细胞株和宫颈癌HeLa细胞株购于上海生命科学研究院。RPMI-1640培养基、噻唑蓝(MTT)、胎牛血清、Trizol试剂、二甲基亚砜(DMSO)和放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液均购于美国sigma公司；E2F1单抗、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2单抗、Bcl-2相关X蛋白(Bax)单抗、β肌动蛋白(β-actin)单抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔或羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G(IgG-HRP)抗体均购于美国Santa Cruz公司；Lipfectamine2000脂质体转染试剂盒、PCR试剂盒、反转录试剂盒、膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒和聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白含量检测试剂盒均购于大连宝生物公司。流式细胞仪、实时定量PCR仪和电泳仪购自美国Becton Dickinson公司，电泳凝胶图像分析系统购于美国Bio-Rad公司，酶标仪和CO2细胞培养箱购于上海赛默飞公司。

1.2细胞培养及转染 人正常上皮293T细胞和宫颈癌HeLa细胞以RPMI-1640培养基于37℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱进行培养，其中培养基中含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素。每2天换液1次，当细胞融合度达70%以上时，加胰蛋白酶消化，以1∶2进行传代培养。取对数生长期的Hela细胞，以完全培养液调整细胞浓度为300 000个/ml，以每孔1 ml接种于96孔细胞板上，培养过夜。当细胞融合度为70%以上时，将细胞分为对照组、miR-136 control组和miR-136 mimics组，按照Lipfectamine2000脂质体转染试剂盒说明书进行转染。miR-136 mimics组细胞中加入miR-136 mimics和转染试剂，miR-136 control组细胞中加入mimics control和转染试剂，对照组细胞中只加入转染试剂。其中miR-136 mimics和mimics control的终浓度为40 nmol/L。上述试剂混合均匀后，常温下反应20 min后，更换为完全培养基，在培养箱中培养6 h后，更换培养基，继续培养48 h后，收集细胞按照1.3中的方法检测其转染效果。

1.3RT-qPCR检测 收集生长对数期的293T细胞和HeLa细胞，加入Trizol试剂0.5 ml反应10 min后，加100 μl氯仿，充分混合后反应20 min，12 000 r/min 4℃离心10 min。取上清液于EP管中，加入异丙醇沉淀RNA，离心，弃上清。以75%乙醇洗涤RNA后，离心，弃上清。加入30 μl焦碳酸二乙酯水溶解RNA。采用紫外分光光度计法测定RNA浓度。根据反转录试剂盒操作步骤逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为25 μl，其中，上下游引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，2×PCR Buffer 12 μl，ddH2O 10 μl。反应条件：94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环。内参基因为U6或β-actin，2-△△Ct法计算miR-136和E2F1的相对表达水平。其中miR-136上游引物为5′-ACACTCCAGCTGGGACTCCATTTGTTTTQ-3′，下游引物为5′-TGGTGTCGTGGA-GTCG-3′；U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；E2F1上游引物为5′-CCCAACTCCCTCTACCCTT-3′，下游引物为5′-CTCCCATCTCATATCCATCCTG-3′；β-actin上游引物为5′-GGACCT-GACTGACTACCTC-3′，下游引物为5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′。

1.4MTT检测 取转染48 h各组对数生长期的HeLa细胞，以每孔50 000个细胞铺板于96孔板上，每组设5个复孔，在CO2培养箱中常规培养48 h后，加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，培养4 h待有蓝色结晶紫产生，加入150 μl DMSO振荡溶解结晶，37℃、避光反应10 min，490 nm波长下酶标仪检测各孔吸光值(OD值)，以(转染组细胞OD/对照组细胞OD)×100%表示各组细胞增殖率。实验重复3次，取平均值。

1.5流式细胞仪检测 转染48 h后各组细胞以0.25%胰蛋白酶消化收集，经磷酸盐缓冲液洗涤后离心，加入结合缓冲液500 μl制成细胞浓度为10 000个/ml的细胞悬液。取1 ml细胞悬液，分别加入5 μl Annexin V-FITC和PI，充分混匀后避光处理10 min，再加入300 μl结合缓冲液，上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。其中每组实验重复3次。

1.6Western印迹检测 收集各组细胞，加入300 μl RIPA裂解细胞，充分摇匀，于冰上反应30 min后离心弃上清，以BCA蛋白浓度检测试剂盒检测其浓度。每孔加入约50 μg的蛋白质，使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺10%分离胶和5%浓缩胶电泳，电泳结束后，取下凝胶，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，于含5%脱脂奶粉的Tris盐酸缓冲液(TBST)中封闭处理1 h，加入一抗(Bcl-2、Bax、E2F1和β-actin抗体)，4℃过夜培养；以TBST每次5 min洗膜3次后，加入二抗(IgG-HRP)，室温下孵育1 h，TBST洗膜3次。避光条件下，在膜上滴加电化学发光(ECL)液显影，以凝胶成像仪进行扫描，计算目的蛋白相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。每组实验均重复3次。

1.7E2F1实验 收集对数生长期HeLa细胞，以每孔1 ml(100 000个/ml)接种于96孔细胞板上，培养过夜。将细胞随机分为siRNA-E2F1组、阴性对照组和未处理组。Lipfectamine2000脂质体转染试剂盒进行转染，其中siRNA-E2F1组加入siRNA-E2F1和转染试剂，阴性对照组中加入E2F1 negative control和转染试剂，未处理组只加入转染试剂。转染6 h后，更换新鲜的完全培养基，继续培养48 h后，按照上述方法分别检测各组细胞中的增殖、凋亡和Bcl-2、Bax、E2F1蛋白表达情况。

1.8统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1miR-136和E2F1在宫颈癌细胞中的表达 与正常上皮293T细胞中的相对表达量(0.96±0.05)相比，宫颈癌HeLa细胞中miR-136的相对表达量(0.35±0.08)显著下降(P<0.05)；但宫颈癌HeLa细胞中E2F1的相对表达量(0.28±0.03)较正常上皮293T细胞中(0.61±0.05)显著升高(P<0.05)。

2.2过表达miR-136对宫颈癌细胞增殖的影响 与对照组相比，miR-136 control组miR-136相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，miR-136 mimics组显著上升(P<0.01)。成功转染后，与对照组增殖率相比，miR-136 control组差异无统计学意义(P>0.05)，miR-136 mimics组显著降低(P<0.01)。过表达miR-136能够明显抑制宫颈癌HeLa细胞增殖。见表1。

表1 miR-136在宫颈癌HeLa细胞中的表达及其对细胞增殖的影响

与对照组比较：1)P<0.01；下表同

2.3过表达miR-136对宫颈癌细胞凋亡的影响 转染48 h后，与对照组〔(8.72±1.16)%〕相比，miR-136 control组细胞凋亡率〔(9.35±1.64)%〕变化不显著(P>0.05)，而miR-136 mimics组〔(35.86±2.28)%〕显著升高(P<0.01)。

2.4过表达miR-136对Bcl-2、Bax和E2F1表达的影响 与对照组相比，miR-136 mimics组细胞中Bcl-2和E2F1蛋白表达量显著降低，Bax蛋白表达量显著升高(P<0.01)。miR-136 control组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，表2。

图1 Western印迹检测Bcl-2、Bax和E2F1蛋白表达

组别Bcl-2BaxE2F1对照组0.48±0.030.18±0.030.36±0.03miR-136 control组0.42±0.050.20±0.060.35±0.03miR-136 mimics组0.23±0.051)0.45±0.081)0.22±0.021)F值25.98318.68824.955P值0.0010.0030.001

2.5沉默E2F1表达后对宫颈癌细胞增殖凋亡的影响 与未处理组相比，阴性对照组细胞增殖率、凋亡率、Bcl-2、Bax和E2F1蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，而siRNA-E2F1组细胞增殖率、Bcl-2和E2F1蛋白相对表达量显著降低，凋亡率和Bax蛋白相对表达量显著升高(P<0.01)。沉默E2F1表达后，HeLa细胞的增殖凋亡趋势与上调miR-136表达结果相一致。见图2，表3。

图2 沉默E2F1表达后对宫颈癌细胞增殖凋亡的影响

组别增殖率(%)凋亡率(%)Bcl-2BaxE2F1未处理组101.02±2.258.55±1.320.51±0.030.22±0.020.32±0.02阴性对照组99.65±4.169.13±2.050.49±0.050.25±0.050.30±0.03siRNA-E2F1组53.48±5.321)34.85±2.161)0.26±0.031)0.54±0.051)0.08±0.031)F/P值130.064/0.000191.350/0.00040.395/0.00052.056/0.00072.546/0.000

与未处理组比较:1)P<0.01

3 讨 论

miRNAs是一类长度约为22个核苷酸的单链RNA，在转录后调控基因的表达，在多种肿瘤细胞的发生过程中发挥类似抑癌基因或原癌基因的作用，具有强大的功能，通过使特定的蛋白合成阻止，实现基因沉默的效果〔7,8〕。miR-136是miRNAs中的重要一员，在多种肿瘤细胞中发挥抗肿瘤的作用，与多种肿瘤的发生和发展关系密切。Yang等〔9〕研究发现，miR-136在胶质瘤中表达下调，通过靶向星形胶质细胞提升基因(AEG)-1和Bcl-2基因在人脑胶质瘤中发挥抑制肿瘤的作用。Yan等〔10〕研究发现，miR-136在三阴性乳腺癌组织中表达下调，肉瘤蛋白活化因子(RASAL)2可能是其靶基因，与miR-136表达呈负相关，过表达的RASAL2使miR-136发挥抑制癌转移的作用。目前，miR-136在宫颈癌中的作用及机制尚不完全清楚，本研究结果显示miR-136在宫颈癌细胞中呈现低表达，过表达miR-136可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。

Bcl-2家族是线粒体途径调控细胞凋亡的主要基因，Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，与宫颈癌等多种肿瘤的细胞凋亡过程关系密切，是细胞凋亡最常见的评判指标〔11,12〕。E2F1是核转录因子(NF)E2F家族中研究最为广泛的一员，在细胞周期G1/S期转换过程中发挥重要作用，进而起到抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。大量研究显示，Bcl-2、Bax和E2F1与宫颈癌的发生发展密切相关〔13，14〕。Zhou等〔15〕研究指出，Bcl-2在宫颈癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织；韩娜娜等〔16〕研究发现，与正常或慢性宫颈炎宫颈组织相比，Bcl-2表达均有不同程度的升高，Bax表达降低；辛乐等〔17〕研究发现，E2F1在宫颈癌组织中的阳性表达率明显高于慢性宫颈炎宫颈组织。本研究结果提示，过表达miR-136可能通过下调E2F1表达调控细胞周期G0/G1向S期过度，进而抑制细胞增殖，通过上调Bax表达和下调Bcl-2表达促进细胞凋亡。通过生物学信息发现E2F1 mRNA的3′非翻译区p′UTR与miR-136间有一个在物种间保守的结合位点，推测E2F1可能是miR-136的靶基因。Chen等〔18〕研究发现，miR-136通过靶向E2F1可以逆转胶质瘤细胞的顺铂敏感性。本研究结果发现，E2F1在HeLa中呈现高表达，与miR-136表达可能存在负相关；沉默E2F1后细胞的增殖凋亡趋势与上调miR-136表达后的趋势相一致，提示E2F1与miR-136具有相反的生物学功能。目前，已有研究证实miR-136与Wnt /β-catenin信号通路关系密切，miR-136在宫颈癌中的作用机制还有待更深入的研究〔19〕。另有研究发现，E2F1可通过激活NF-κB的经典信号通路调控survivin的表达，从而在肿瘤细胞中发挥促进细胞增殖，抑制细胞凋亡的作用〔20〕。综上，miR-136在宫颈癌细胞中呈现低表达，上调其表达可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，其作用机制可能与E2F1有关。