耐寒和非耐寒橡胶树幼苗叶片抗氧化及抗坏血酸-谷胱甘肽循环对低温胁迫的反应差异

孔广红,郭建春,刘 姣,姚 远,李瑞梅,柳 觐,李国华，和丽岗,胡新文

(1.海南大学热带农林学院,海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南 海口 571101；3.云南省热带作物科学研究所,云南 景洪 666100)

【研究意义】橡胶树 (Heveabrasiliensis) 系大戟科(Euphobiaceae)三叶橡胶树属(Hevea)，原产于南美洲北纬 5° 至南纬 15°、西经 48° 至 78° 亚马逊河流域的巴西、秘鲁、哥伦比亚、委内瑞拉和圭亚那等国[1]。南北纬 10° 的热带地区是橡胶树的传统种植区[2], 中国的植胶区分布于北纬 18°至 24°的热带北缘地区(主要是海南、云南和广东)，属于非传统植胶区[3]。【前人研究进展】橡胶树在生长发育过程中，低温寒害是经常面对的非生物胁迫，且几乎每年都会发生，严重影响橡胶树的经济寿命及橡胶单产[4]。低温寒害是制约我国橡胶产业发展的最主要的环境限制因子[5]。植物遭遇非生物胁迫时其耐受力会提高是与植物增加营养吸收、改变体内激素平衡、增强活性氧清除系统活性和渗透调节物的合成有关[6]。通常情况下，植物体内活性氧的产生和清除处于动态平衡状态，当植物遭受逆境时，代谢平衡被打破，产生大量的活性氧自由基，使得膜系统的完整性降低，电解质及有机小分子物质外渗，导致一系列生理生化代谢紊乱[7]。【本研究切入点】关于橡胶树对低温胁迫的生理响应已有众多报道，大多集中于低温胁迫对某些生理生化指标的影响[8]，以此研究橡胶树的抗寒性生理机制，但是低温胁迫下橡胶树不同耐寒性品种间其酶促反应和非酶促反应的差异尚未见报道。【拟解决关键问题】选择耐寒和非耐寒 2 个橡胶树无性系，研究耐寒和非耐寒无性系橡胶树幼苗在低温逆境下叶片抗氧化系统及抗坏血酸-谷胱甘肽循环的反应差异，探索低温控制橡胶树幼苗的生理响应机制，为橡胶树耐寒性种质资源筛选以及后续开展以低温胁迫系统关键基因改良橡胶树种质资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以耐寒橡胶树无性系 ‘云研 77-4’ 和非耐寒无性系 ‘热垦 501’ 为供试材料。品种 ‘云研 77-4’ 是云南省热带作物科学研究所选育出的抗寒、高产、速生、副性状良好的自主品种，亲本为 ‘GT1’ × ‘PR 107’[9]。品种 ‘热垦 501’ 是引进的低温敏感种质材料，来自 ‘RRIM600’× ‘PB260’ 杂交组合[10]。2 个品种的压条均取自云南省热带作物科学研究所的橡胶树增殖圃，以橡胶树品种 ‘GT1’ 的实生苗为砧木。2017年11月进行芽接，待接穗成活后，锯掉树桩，使接穗快速生长，按照橡胶树栽培管理技术规程进行抚育管理，当无性系幼苗长至2蓬叶稳定期时，开展相关试验。

1.2 试验方法

1.2.1 处理温度的设置 橡胶树生长的最适温度条件为年平均温度(28±2) ℃, 昼夜温差约7 ℃[11]。相关研究表明橡胶树抗寒性强的品种低温半致死温度在-4～0 ℃， 抗寒性弱的品种低温半致死温度在4～7 ℃[12]。因此设置橡胶树生长的最适温度 28 ℃/ 28 ℃(昼/夜)为对照处理温度，4 ℃/ 4 ℃(昼/夜)为低温胁迫温度。

1.2.2 试验设计 选取长势一致的 2 蓬叶稳定期幼苗作为试验材料，2 个无性系在对照温度(28 ℃)和低温胁迫温度(4 ℃)下各处理1、12、24 h，试验共计 12 个处理，每处理 3 次重复，以 5 株幼苗为一重复。试验材料放置于人工气候室进行处理，人工气候室的光照设置为白天(光照) 12 h、夜间(黑暗) 12 h，相对湿度 70 % 左右。各处理均取第 2 蓬叶片进行生理指标测定，采集样品用液氮速冻后保存于-80 ℃ 超低温冰箱，试验材料处理完成后集中测定各项生理指标。

1.2.3 生理生化指标的测定 采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒测定过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性、过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性、过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-PX)活性、抗坏血酸(Ascorbic acid, AsA)含量，操作步骤按使用说明书进行。

1.2.4 数据处理 试验数据的统计和分析采用 SPSS 20.0 软件及LSD多重比较(P<0.05)，图表绘制采用 Microsoft Excel 2010软件。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对橡胶树幼苗抗氧化系统的影响

2.1.1 低温胁迫对橡胶树叶片 H2O2含量的影响 由图 1 可知，随着处理时间的延长，低温处理(4 ℃)与对照(28 ℃)相比，2 个橡胶树无性系幼苗叶片 H2O2含量均呈现降低-升高-降低的趋势；‘热垦 501’ 的 6 个处理差异不显著；‘云研 77-4’ 在处理 1和 12 h 时低温胁迫与对照相比差异显著。处理 1 h后， 28 ℃ 条件下 ‘云研 77-4’ 幼苗叶片的 H2O2含量最高，与 ‘热垦 501’ 相比差异不显著，显著高于 4 ℃ 处理下 ‘云研 77-4’ 和 ‘热垦 501’ 的 H2O2含量。处理 12 h后，4 ℃ 低温条件下 ‘云研 77-4’ 幼苗叶片的 H2O2含量最高，显著高于自身对照，与非耐寒无性系 ‘热垦 501’ 28 ℃ 及 4 ℃ 处理相比差异达显著水平。‘热垦 501’ H2O2含量在 28 ℃ 及 4 ℃ 处理之间含量上升，但差异不显著。处理 24 h 后，2 个无性系的低温处理与对照相比，H2O2含量均有所下降，但差异未达显著水平。结果表明低温胁迫处理后非耐寒无性系 ‘热垦 501’ 幼苗叶片中 H2O2含量变化不大，‘云研 77-4’ 则随低温处理时间延长显著上升或者显著下降，说明在低温的刺激下，耐寒性无性系 ‘云研 77-4’ 对低温逆境快速做出反应，以抵御不良环境对其造成的影响，同时内源 H2O2脉冲式的产生，将有助于耐寒无性系 ‘云研 77-4’ 增强酶和非酶系统的活性。

2.1.2 低温胁迫对橡胶树叶片抗氧化酶活性的影响 图 2-A 是低温胁迫下 SOD 酶活性变化图，随着低温处理时间的延长，‘云研 77-4’ 的 SOD 活性产生了显著变化，4 ℃ 低温处理 12 h 后达到最大值，显著高于1和 24 h ，以 12 h 作为拐点形成急剧上升和急剧下降的趋势，3 个时间点中低温处理的酶活力与对照酶活力相比呈现降低-升高-降低的变化趋势。‘热垦 501’ 在各个时间点酶活力的表达也呈现降低-升高-降低的变化趋势，但只是缓慢的起伏，差异未达显著水平。4 ℃ 条件下，处理 1 h 时，‘云研 77-4’ 与 ‘热垦 501’ SOD 活力在同一水平；处理 12 h ，‘云研 77-4’ SOD 活力显著高于 ‘热垦 501’；处理 24 h，‘云研 77-4’ 与 ‘热垦 501’ SOD 活力又回落至 1 h 时的水平。

由图2-B 可见，处理 1 h后，耐寒无性系 ‘云研 77-4’ 和非耐寒无性系 ‘热垦 501’ 在 4 ℃ 低温胁迫下 POD 活力均低于对照温度(28 ℃)处理条件下的 POD 活力，但 ‘云研 77-4’ POD 活力与对照相比显著下降，说明 ‘云研 77-4’POD 活力下降的幅度大于 ‘热垦 501’。处理 12 h 后，低温条件下 ‘热垦 501’POD 活力与自身对照相比变化不大，‘云研 77-4’ POD 活力与自身对照相比显著升高。处理 24 h 后， 2 个无性系 4 ℃ 低温处理的 POD 活力与对照相比均有所下降，但下降幅度差异未达显著水平。随着低温处理时间的延长，‘云研 77-4’ 在低温处理 12 h 后 POD 活力显著高于 1和 24 h；‘热垦 501’ 在低温处理 12 h 后 POD 活力高于1 24 h，它们之间差异不显著。‘云研 77-4’ 的 POD 活力在低温处理 1，12，24 h 时均高于 ‘热垦 501’。3 个时间点 2 个无性系低温处理的酶活力与自身对照酶活力相比均呈现降低-升高-降低的趋势。

不同小写字母表示在 0.05 水平上差异显著。下同Different lowercase letters indicated significance at 0.05 level. The same as below图1 低温胁迫对橡胶树叶片 H2O2 含量的影响Fig.1 Effects of low temperature stress on the H2O2 content in rubber tree seedlings’ leaves

图 2-C 显示低温胁迫下 CAT 活性的变化趋势。CAT 活力变化趋势与 SOD、POD 的变化趋势一致。在4 ℃ 低温条件下， ‘热垦 501’ 的酶活力与自身对照相比呈现降低-升高-降低的变化趋势，各处理之间差异未达显著性水平；‘云研 77-4’ 同样呈现降低-升高-降低的趋势，在 1和 12 h 时低温处理和对照之间差异达显著性水平；处理1、24 h 时，‘云研 77-4’ 的 CAT 活力高于 ‘热垦 501’，处理 12 h ，‘云研 77-4’CAT 活力显著高于 ‘热垦 501’。说明在遭遇低温胁迫时 ‘云研 77-4’ CAT 活力比 ‘热垦 501’ 高，也能迅速的对低温产生响应。

综上所述，在最适生长条件下，抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活力保持稳定水平，24 h 内昼夜节律对它的影响不大；遭遇低温时，耐寒无性系调节抗氧化酶活力的能力强于非耐寒无性系，进一步证明耐寒无性系通过提高酶活性抵御过多 ROS 对机体的伤害，从而提高耐寒性。

2.2 低温胁迫对橡胶树幼苗抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响

2.2.1 低温胁迫对橡胶树幼苗抗坏血酸(AsA)含量的影响 由图 3 可知，对照和低温处理条件下，3 个时间点中，‘云研 77-4’ 抗坏血酸含量(AsA)均显著高于 ‘热垦 501’。随着低温处理时间的延长，‘热垦 501’ AsA 含量与 ‘云研 77-4’ 相比一直处于比较低的状态，在 4 ℃ 低温条件下不同时间点有一个小幅度的波动，但差异未达显著水平，呈现低-高-低的趋势。‘云研 77-4’ AsA 含量低温处理1 h时显著低于自身对照，12 h 时显著高于自身对照，也显著高于 1和24，24 h 时低于自身对照。由此可见抗坏血酸(AsA)可以作为衡量橡胶树耐寒性的一项重要生理指标。

A：低温胁迫下 SOD 酶活的变化；B：低温胁迫下 POD 酶活的变化；C：低温胁迫下 CAT 酶活的变化A: Changes of SOD activity under low temperature; B: Changes of POD activity under and low temperature; C: Changes of CAT activity under low temperature图2 低温胁迫对橡胶树幼苗叶片抗氧化酶活性的影响Fig.2 Effects of low temperature stress on the activity of antioxidant enzymes in rubber tree seedlings’ leaves

图3 低温胁迫对橡胶树幼苗 AsA 含量的影响Fig.3 Effects of low temperature stress on the AsA content in rubber tree seedlings’ leaves

2.2.2 低温胁迫对橡胶树幼苗谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性的影响 图 4-A 可见，对照温度(28 ℃)条件下，耐寒无性系 ‘云研 77-4’ 和非耐寒无性系 ‘热垦 501’GSH 含量均比较稳定。处理温度(4 ℃)条件下，‘云研 77-4’ GSH 的含量于处理 1和24 h 时高于 ‘热垦 501’，差异未达显著水平，处理12 h 时显著高于 ‘热垦 501’。与自身对照相比，2 个无性系在 3 个时间点的GSH 含量均呈现降低-升高-降低的趋势。随着低温处理时间延长，2 个无性系同样呈现低-高-低的趋势。由此可知 12 h是 GSH 含量变化的一个拐点时间，GSH 的含量出现周期震荡。

由图 4-B 可见，处理 1 h 后，2 个无性系在低温胁迫下 GSH-PX 活力分别与各自对照相比变化不大，但 ‘云研 77-4’ 的酶活力在 28和 4 ℃ 条件下均显著低于 ‘热垦 501’。处理 12 h 后，低温胁迫下 ‘热垦 501’ 的 GSH-PX 活力与自身对照相比显著下降；‘云研 77-4’ 的酶活力与对照相比稍微提高，但增加的幅度很小；在 28 ℃ 条件下 ‘云研 77-4’ 的酶活力显著低于 ‘热垦 501’，在 4 ℃ 条件下，‘云研 77-4’ 的酶活力低于 ‘热垦 501’，差异不显著。处理 24 h 后，4 ℃ 条件下 2 个无性系的 GSH-PX 活力均强于各自对照；‘云研 77-4’的酶活力在 2 个温度条件下均低于 ‘热垦 501’。随着处理时间的延长，‘云研 77-4’GSH-PX 活力与自身对照比较，呈现下降-上升-上升的趋势；‘热垦 501’ 呈现上升-下降-上升的趋势。GSH-PX 是机体内广泛存在的一种重要的催化 H2O2分解的酶，它以 GSH 为底物特异的催化反应，可以保护细胞膜结构和功能的完整，所以出现了 2 个无性系的 GSH-PX 活力与 GSH 含量的变化趋势呈现相反的趋势，即在同一时间点 GSH-PX 酶活力高时 GSH 含量低，GSH-PX 酶活力低时 GSH 含量高。

A：低温胁迫下 GSH 含量的变化；B：低温胁迫下 GSH-PX 酶活的变化A: Changes of GSH content under low temperature; B: Changes of GSH-PX activity under and low temperature图4 低温胁迫对橡胶树幼苗叶片 GSH 和 GSH-PX 的影响Fig.4 Effects of low temperature stress on the GSH content and activity of GSH-PX in rubber tree seedlings’ leaves

3 讨 论

自然环境中存在昼夜温差，即使在昼夜温度波动较大的情况下，昼夜节律在一定温度范围内保持相对恒定，即昼夜节律的温度补偿效应[19]。本研究显示，耐寒无性系 ‘云研 77-4’ 和非耐寒无性系 ‘热垦 501’ 在昼夜温度为 28 ℃/28 ℃的处理条件下，3 个时间点中各项生理指标均处于相对稳定水平，说明适于橡胶树生长的温度条件下，昼夜节律对 2 个橡胶树品系的抗氧化酶活性及抗坏血酸-谷胱甘肽循环影响不大，验证了昼夜节律的温度补偿效应。在遭受非生物胁迫时，植物为了自我保护以便能更好的适应环境变化，昼夜节律也会随之发生变化[20]。本研究显示，随着低温胁迫时间的延长，2 个橡胶树无性系的抗氧化酶活性及抗坏血酸-谷胱甘肽循环均呈现较大的变异，差异达到显著性水平，且 2 个无性系的变化均以 12 h 为拐点，说明耐寒性不同的橡胶树幼苗对低温胁迫产生不同的响应机制。

4 结 论

研究显示耐寒和非耐寒无性系橡胶树叶片抗氧化和抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统在低温胁迫下的反应差异，表明叶片抗氧化及抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统与橡胶树幼苗耐寒性密切相关，为橡胶树耐寒性种质资源筛选以及后续开展以低温胁迫和昼夜节律系统关键基因改良橡胶树种质资源提供理论依据。