畜禽精液冷冻损伤保护研究进展

喻宗岗，蒋 隽，燕海峰*，谢农村

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128；2.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙 410131；3.湖南佳牛牧业有限公司，湖南长沙 410143）

在采精、稀释到冻精制作这一系列过程中，精液处于离体状态，精子所处的环境骤变。精液稀释时各种稀释液和抗冻剂的添加导致胞内组分增加，渗透压、pH与体内不一致导致精子正常机能受限或受损[1]；离体操作使精子较长时间与空气接触，精液中氧含量升高导致精细胞内形成氧化自由基，各种酶活性降低，氧化还原平衡状态被打破造成精子氧化损伤[2]；冷冻过程中温度骤降所导致的胞内水冰晶化造成精子机械损伤[3]。这些改变都不同程度地影响精子的正常机能，其中对精子机能影响最显著的是温度骤降使水冰晶化造成的机械损伤和精液中氧含量升高造成的氧化损伤[4]。本文主要从氧化损伤、机械损伤的机理及减轻损伤的途径进行综述，以期为进一步提高畜禽冷冻精液品质提供思路，切实提高畜禽冻精品质。

1 冷冻精液的抗氧化损伤及抗氧化剂应用

1.1 氧化损伤原理 冷冻精液氧化是指精子结构成分的氧化，包括脂质氧化、蛋白质氧化、核酸氧化和糖类氧化[5]。精子膜由大量脂类、少量的糖和蛋白质构成，而冷冻过程中形成的大量活性氧（ROS）首先会与膜上的脂类发生氧化反应，因此脂类氧化对精子的危害最大。

精液从液态变为固态的过程中，由于冷冻刺激使精细胞代谢异常骤然产生大量ROS，当ROS浓度超过精细胞内抗氧化系统清除上限时，ROS便会过度积累，打破氧化物和抗氧化物之间的动态平衡，此时细胞膜上的脂类物质就会发生氧化，此时精细胞便处于氧化应激状态[5]。氧化应激会导致细胞膜通透性增强，膜上离子通道受损，膜外钙离子大量进入胞内，钙离子失衡的精子内部代谢紊乱，胞内维持细胞正常机能的酶外泄，当膜氧化受损严重时ROS会进入胞内，氧化胞内遗传物质DNA[1]。当氧化应激水平超过细胞承受上限时，细胞死亡[2,5]。

1.2 抗氧化剂的抗氧化机制及在畜禽冻精中的应用 抗氧化剂对于防止精液脂类氧化尤为关键，主要有维生素类、氨基酸类、酶类、糖类、蛋白类。

1.2.1 维生素类及其衍生物 细胞膜上含有大量的多不饱和脂肪酸（PUFA），当脂肪酸受到自由基攻击时，精细胞膜就会发生脂质过氧化反应。只要在中途将介导因子自由基清除，链式脂质过氧化反应过程就会中断[6]。反应方式：

上述反应中过氧化自由基过氧化物是由氧化自由基的产物与氧结合形成，过氧化物供氢与维生素类抗氧化剂结合阻止过氧化自由基的形成，反应链就会中断，从而防止细胞膜上脂类被氧化。

在冻精中添加的维生素种类主要是维生素B12、维生素C、维生素E、番茄红素。添加维生素B12显著提高了藏羊冻后精子活力和顶体完整率[7-8]。添加维生素C显著提高猪精子的冻后活力、质膜完整率和顶体完整率[9-10]和活率[9]及线粒体活性、抗氧化酶活性、精子存活时间[10]。在鸡[11]和山羊[12]冻精中添加番茄红素，鸡受精效果不明显，显著提高了山羊精子活率、顶体完整性、质膜完整性和线粒体活性。在鸡[13]、猪[14]冷冻精液中添加维生素E，鸡精子活力、鸡和猪的精子活率和质膜完整性均显著提高，鸡精子脂质过氧化水平显著降低。以上维生素类都提高了冻后精子活力和顶体完整率，但是除了鸡的受精率外，对生产有效果的指标几乎没有涉及。

1.2.2 氨基酸类 作为抗氧化剂的氨基酸主要是谷氨酰胺、牛磺酸、亚牛磺酸、半胱氨酸、肉碱。氨基酸抗氧化机制有4种：一是直接清除自由基或活性氧；二是螯合金属离子或还原金属离子阻止其催化氢过氧化物生成氧自由基；三是与其他抗氧化剂发挥协同抗氧化作用；四是氨基酸与某些氧化脂质发生化学反应生成的次级产物具有抗氧化作用[15]。氨基酸在畜禽精液冷冻过程中的抗氧化机制主要以第4种为主。

在鸡精液稀释基础液中添加氮乙酰半胱氨酸（NAC）后冷冻，其冷冻精液受精效果不明显[11]；精子活力和质膜完整性极显著提高，且细胞凋亡显著减少[16]。在鸡冻精中添加谷氨酰胺显著提高了活力、活率和质膜完整性[17]。添加牛磺酸显著提高了内蒙古绒山羊[18]、鸡[19]和猪[20]冷冻精液的精子活率，显著提高了马[1]和猪[20]的精子活力、猪的精子顶体完整性[20-21]、鸡的染色体完整性[19]和猪的质膜完整性[20]；显著降低了鸡[19]和猪[20-21]脂质过氧化水平、鸡[19]和猪[20]线粒体活性、鸡[19]的细胞凋亡水平。以上含硫氨基酸及其衍生物都是通过与自由基发生反应起到抗氧化作用。添加肉碱显著提高了鸡[22]、人[23]和猪[20,24]的精子活率和活力，提高了猪[20,24]的线粒体活性、顶体完整性和质膜完整性；降低了鸡[22]、猪[20,24]和水牛[25]的脂质过氧化水平。

1.2.3 酶类 精子膜有一个抗氧化系统，拥有抵御ROS和脂质过氧化作用（LPO）的保护机制，主要包括超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽 （GSH）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和其他的一些抗氧化物质[2]。

冻精中添加的抗氧化酶类主要是SOD、GSH、CAT等[11]。冻精中添加CAT，鸡受精效果不明显[11]，猪精子活力、活率、质膜完整率和顶体完整率极显著提高[9]。添加SOD显著提高鸡冻后精子活力[15]、鸡和猪质膜完整性[14-15]、猪冻后精子活率[14]。关中驴冻精中添加GSH及猪冻精中联合添加100 IU/mL SOD+200 IU/ mL CAT，显著提高冷冻-解冻后猪和关中驴精子活率和质膜完整率及顶体完整率、猪精子活力及关中驴的冻后精子活率和线粒体完整性[9,26]。

1.2.4 糖类及其衍生物 糖类抗氧化机制可能是抑制氧自由基形成，提高过氧化物酶活性，防止胞内酶外流，减少细胞脂质过氧化，保持细胞膜通透性，但是具体机制还不明确[27]。透明质酸可以使精子呈现均匀分布的状态，因为其本身的高粘滞性所带来的细胞空间的适当渗透压防止了细胞的聚集作用，从而防止了局部聚集区域缺氧而导致的细胞死亡。透明质酸能够吸收水分，从而能形成一个低浓度的水溶胶结构。透明质酸本身携带的负电荷可以吸附溶液中对顶体反应中起关键作用的阳离子，尤其是钙离子，这种吸附作用可以预防顶体反应的发生[28]。

糖类主要是海藻糖、海带多糖、红景天多糖、透明质酸。冻精中添加海藻糖显著提高了山羊和牛精子活力[18,20,29]、山羊[18,29]精子质膜完整率和顶体完整率、山羊[18]精子活率和线粒体活性，降低牛精子畸形率[30]；关中驴[26]、鸡[31]冻精中添加海带多糖均显著提高了冻后精子活率、质膜和顶体完整率以及线粒体活性；冻精中添加红景天多糖显著提高了藏猪[32]和鸡[31]精子活率、顶体完整率、质膜完整率及鸡[31]精子线粒体活性，降低了藏猪精子畸形率[32]；在猪和鸡精液中添加透明质酸显著提高了活力和顶体完整性，显著提高了猪活动精子百分率，显著降低了猪和鸡的氧化应激水平，还显著提高了鸡的受精率和孵化率[9,33-35]。

1.2.5 白藜芦醇 除以上抗氧化剂外，白藜芦醇被广泛应用于畜禽及人冻精中。白藜芦醇是一种天然的植物类抗氧化物质，具有亲脂性的非黄酮类多酚化合物是其抗氧化功能成分，该酚类化合物能够抑制线粒体呼吸链中的复合酶Ⅲ的活性，防止ROS产生，其酚羟基可以清除芬顿反应产生的氢氧自由基等ROS，抑制脂质过氧化，它还可以调节GSH等抗氧化相关酶活性发挥抗氧化作用[36]。

在人冻精中添加白藜芦醇，避免了精液冷冻保存造成的精子氧化损伤[37]、减少了精子DNA损伤和提高了保存精子的结构完整性[38]；诱导增加的AMP依赖的蛋白激酶（Adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated Protein Kinase，AMPK）活性对冷冻状态下精子DNA完整性和关键父本转录物有保护作用[39]。

在猪、牛、羊冻精中添加白藜芦醇，显著降低了山羊精子DNA损伤率[40]、水牛精子获能状态和氧化应激[41]；显著提高了水牛精子膜稳定性和体外受精能力[41]、猪的精子活力[42]、牛的精子活率[43]、猪和牛的精子顶体完整性和精子质膜完整率[42-43]。

2 机械损伤及其控制

2.1 机械损伤原理 在精液冷冻过程中，有一个危险温区，即液体发生强烈结晶过程的温度范围。该温度范围会导致冰晶增长及盐溶液浓缩，冰晶增长及盐溶液浓缩会严重损伤细胞的脂蛋白膜。这个危险温区通常在-50～0℃，最有害区是-25～-15℃[44]。温度降低到冰点时会使精液中胞外水由液态转化为固态，胞外水减少渗透压升高，稳态被破坏，细胞失水皱缩，随着时间的增长胞内水也会结晶，胞内外水形成冰晶汇集体积增加，严重损伤胞内细胞器、酶及染色体等功能物质，导致细胞正常生存、获能及受精机能降低甚至丧失，还会导致精子膜通道受阻，精子膜破损甚至精细胞裂解死亡[1]。

减轻液体结晶化造成的机械损伤有2种方式：一是通过向精液中添加抗冻剂；二是通过控制降温速率快速越过危险温区。

2.2 抗冻剂 在精液冷冻过程中，由于温度骤降会使精液内的水结晶，水结晶会对精子造成机械损伤，严重限制精子的生理机能。抗冻剂是一种防止水在冷冻过程中由于温度骤降而形成冰晶的物质，在精液中添加抗冻剂是必需的。渗透性抗冻剂可以渗入细胞内与胞内水结合减少胞内水结晶，增加胞内渗透压而吸收胞外水减少胞外水冰晶化，从而降低水冰晶化的机械损伤，增加了细胞膜的流动性使精子正常机能得以维持[45]。

抗冻剂主要有甘油（glycerol）、二甲基乙酰胺（DMA）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、甲基乙酰胺（MA）、甲酰胺（Formamide），使用最广泛的是甘油和DMA[11]。

在鸡冻精中的研究结果均证明DMA的毒害作用小于甘油[46-47]，添加DMA和DMSO显著提高了鸡精子活率[46]，DMA冻精的受精率显著高于甘油冻精[47]；柴局[18]研究报道，在山羊精液中添加DMSO精子质膜完整性显著高于EG、丙二醇，原因是DMA和DMSO的相对分子量小、粘度低、通透性强[46]。另外，联合使用不同种抗冻剂的效果良好。Mosca等[48]研究报道，联合添加渗透性冷冻保护剂MDA和非渗透性冷冻保护剂海藻糖显著提高了鸡精子活力和精子复苏率；张育军[49]研究报道，在安徽绒山羊精液稀释液中添加1%MDF和6%甘油显著提高了精子活率。除海藻糖外，以上添加的抗冻剂均为渗透性抗冻剂，它可渗入胞内结合胞内水，防止胞内水形成冰晶且可使水处于过冷状态，降低结晶温度[46]，由此可见渗透性抗冻剂应用更广泛。

近几年研究报道，环糊精也有良好的抗冻作用。Partyka等[50]报道，2-羟丙基-β-环糊精增加了精子脂膜流动性，防止脂膜变成凝固态，减少解冻精子的冷冻损伤，提高了冷冻保存后精子活率和运动力。在猪、鸡精液稀释基础液中添加高胆固醇环糊精，极显著提高了鸡冻后精子活力、顶体完整性，降低线粒体膜电位、受精率[51]，提高冻融后猪精子的活力、精子活率、顶体完整率和减少线粒体的损伤[52-53]。

2.3 冷冻速率

2.3.1 合适冷冻速率减轻机械损伤的原理 合适的冷冻速率能够使精子内部的水有足够的时间向外渗出，这样会使细胞内外的化学势达到平衡，细胞内形成少量小冰晶，此时对精子造成的损伤小，精子生存率高。冷冻速率过快，细胞中的水渗出不充分，未渗出的水会形成大量体积庞大的冰晶，这些大冰晶对细胞有较大伤害，精细胞生存率降低；如果冷冻速率过慢，虽然化学势达到平衡，但会形成较大的冰结晶，不利于精子生存[54]。因此，冷冻速率是冷冻精液质量产生较大差异的因素。

2.3.2 冷冻速率控制途径 控制冷冻速率的措施有程序仪控制和液氮熏蒸法。冷冻程序仪控温速率更加精准，但是设备昂贵；相比之下液氮价格较低，且熏蒸简单易行。

张凯等[55]研究报道，以10%的DMSO作为冷冻保护剂，使用冷冻程序仪以7℃/min的冷冻速率，从5℃降至-35℃，再以9℃/min的冷冻速率，从-35℃下降至-120℃，这样处理过的鸡精液冷冻解冻效果最好。王捷等[56]报道，将0.25 mL猪细管精液放入程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃降至-5℃，当温度恒定在-5℃时，将细管置于液氮面3 cm上方熏蒸10 min，迅速投入到液氮中保存，解冻后精子功能完整性显著提高。常永梅等[57]报道，藏羊细管精液冷冻曲线为4～-10℃（降温速率 5℃/min）、-10～-100℃（降温速率55℃/min）、-100～-140℃（降温速率 20℃/min）时，精子冻后质量较好。不同动物使用的都是三段冷冻法，但下限温度的设定不同，这可能与物种精子性质有关，且在初始-中段-末段降温速率依次为低-高-中，前段慢速降温使抗冻剂有充分的时间渗透入细胞内与胞内水分结合，中段快速降温可快速越过危险温区减少冰晶形成。

当外部处于恒定室温下，内部充有部分液氮的液氮罐，其液氮上部空间的温度分布相对稳定，通过调整样品在液氮罐中的位置，可以控制样品的降温速度、保温时间、深冷次数和停留时间等参数，实现对样品的最佳保存，为各种实际应用提供便利条件[58]。

在液氮面上不同的距离处熏蒸不同时间即获得不同的冷冻速率。邓溯顺等[59]将DMA细管精液置于液氮面上1 cm处熏蒸10 min后置于液氮中冷冻，解冻后获得较好的活力；Long等[60]将DMA细管精液置于液氮面上1.25 cm处熏蒸2 min后置于液氮中冷冻，解冻后人工输精获得较好的受精率；Kowalczyk等[61]将MDF细管和颗粒精液置于液氮面2 cm处熏蒸3 min后置于液氮中冷冻，解冻后获得较高的活率；将DMA细管精液置于液氮面3 cm处熏蒸1 min后置于液氮中冷冻，解冻后显著提高精子复苏率[48,62]、活力[48]；将甘油细管冻精在液氮面上4 cm处熏蒸7 min后解冻精子活力和活率[17,22,35]、顶体完整性[22]、线粒体膜电位[17]、脂质过氧化水平和获能力[22,35]以及受精率[17]都显著提高；Abouelezz 等[47]将甘油细管和DMA细管置于液氮面上7 cm处熏蒸10.5 min解冻后人工输精，DMA细管显著提高精子活力和受精率。以上研究者均采用一步熏蒸法，即在冻精置于液氮面上某一距离熏蒸一定的时间后直接置于液氮中冷冻。也有研究者采用两步熏蒸法，即在液氮面上2个不同距离熏蒸一定时间后置于液氮中冷冻。阳小胡等[63]将甘油细管冻精先置于液氮面上17 cm处熏蒸1～5 min，再置于1 cm处熏蒸1～5 min后置于液氮中冷冻，解冻后精子活力显著提高。Chuaychu-noo等[51]将MDF细管先置于液氮面上11 cm处熏蒸12 min，再于3 cm处熏蒸5 min后置于液氮中冷冻，解冻后精子质量显著提高。一步熏蒸法熏蒸距离主要集中在1～4 cm处，但是熏蒸时间跨度很大，这可能与研究者使用的液氮量及液氮面上蒸汽层的高度不同有关，应进一步筛选并规范化。两步熏蒸法增加了步骤和相关环节，相比之下一步熏蒸研究更多。

3 展 望

目前，大量抗氧化剂被用于冷冻精液冷冻研究中，但仍存在实验结果不一致、有受精率的结果少、哪种或哪类抗氧化剂才是高效抗氧化剂、每种或各类抗氧化剂影响精子冻后质量的具体作用机制还不清楚等问题。此外，冷冻保护液的组分和含量直接影响液体的酸碱度和渗透压，冷冻速率也可能通过温度的变化等不同程度地对抗冻剂的扩散和分布造成影响。未来对于精液冷冻的研究应该致力于高效抗氧化剂的筛选、各种抗氧化剂对精子冻后质量作用的具体机制、联合使用各种抗氧化剂对精子不同结构机能的作用以及精液冷冻保护液中的抗冻剂、抗氧化剂和冷冻速率间的互作效应等方面。