黄羽肉鸡青胫性状变化规律及遗传分析

2019-02-28党李苹王哲鹏

中国畜牧杂志 2019年2期

白云，党李苹，陈航，王斌，王哲鹏 *

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.略阳县畜牧兽医总站，陕西略阳 724300）

黄羽肉鸡的外貌特征对其市场销售具有重要影响，如三黄（黄羽、黄喙和黄胫）特征通常给消费者传递“土鸡”、“味道鲜美”、“营养价值高”等信息，成为消费者选购的重要标准之一[1-2]。但在黄羽肉鸡的选育中总有部分个体胫色发青，给黄羽肉鸡的销售带来不利影响。

鸡的青胫表型是由真皮沉积黑色素引起，受真皮黑色素抑制基因（Id）的调控[3]。Id 位点曾被定位到Z染色体上，携带显性等位基因（Id）的个体将表型为白胫或黄胫，而携带隐性等位基因（id+）的个体将表现为青胫[3-4]。Dorshorst等[3]基于关联定位结果提出，B4GALT1（β-1,4-Galactosyltransferase 1，β-1,4-半乳糖转移酶1）可能是对应于Id位点的候选基因，但因果突变尚未被克隆。除了Id位点外，一些调控皮肤颜色的基因也可能对青胫的外显产生干扰，如鸡的黄皮肤基因BCDO2（β-Carotene Dioxygenase 2，β-胡萝卜素双加氧脱氢酶）[5]。BCDO2是一个可将有色的类胡萝卜素分解为无色的脱辅基类胡萝卜素的酶。当BCDO2基因突变时会抑制类胡萝卜素分解，引起黄皮肤表型[5]。如果选育的黄羽肉鸡也携带BCDO2基因，则青胫表型的外显率极有可能受饲料中核黄素、叶黄素等天然色素的干扰，给选育提纯增大难度。

本研究旨在分析日龄、饲料、药物等非遗传因素对黄羽鸡青胫表型外显率的影响，检测Id位点和BCDO2基因在金陵黄鸡群体中的分布情况及与青胫表型的关联性，为黄羽肉鸡青胫选淘方法的建立提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组本研究以广西金陵农牧集团有限公司黄羽肉鸡配套系E系花鸡为研究对象，选取来自同一批次出雏的1 950只祖代鸡，随机分为全价料组、自配料组和药物组，经21 d饲养并去除死淘样本后，其中全价料组629只、自配料组638只、药物组632只。全价料组全期饲喂正大公司肉仔鸡全价配合饲料（表1）；自配料组全期饲喂金陵公司自配料（表1）；药物组饲喂企业自配料，并在饮水中添加1 g/kg氟尔康（氟苯尼考）全期给鸡饲喂，其他饲养条件与全价料和自配料组保持一致。饲养周期为45 d，在21日龄和45日龄由同一名观察人员记录雏鸡胫色。试验动物均在同一栋鸡舍饲养。

表1 日粮组成及营养成分（风干基础）

1.2 血样采集与DNA提取首先在同一黄羽肉鸡群体内，采集30只青胫和26只黄胫鸡血样。罗曼鸡和尼克鸡是已知的肤色与胫色被选育固定为黄皮肤的商业蛋鸡品种，而略阳乌鸡是青胫性状被固定的一个地方品种。因此，本试验采集40只罗曼鸡和15只尼克鸡血样作为黄胫阳性对照，采集15只略阳乌鸡血样作为青胫阳性对照。翅下静脉采血，ACD抗凝（ACD:血液=1:4）。ACD配方为0.48 g 柠檬酸、1.32 g 柠檬酸三钠、1.47 g葡萄糖，用双蒸水溶解后定容至100 mL。

基因组DNA用全血基因组提取试剂盒（TaKaRa）按说明提取。所得DNA用TE缓冲液溶解，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用NanoDrop2000（Thermo）测定DNA浓度并将浓度调至50 ng/μL，4℃储存备用。

1.3 BCDO2基因和Id位点序列变异检测本研究主要对BCDO2基因C位点（BCDO2-SNP）的基因型[5]、Id位点的rs14686603（Id-SNP）及位于B4GALT1 3'UTR的1个SNP（B4G-SNP）[3]进行检测（表2）。

SNP基因型用PCR-RFLP检测，部分结果用Sanger测序进行验证。PCR-RFLP检测所用引物和内切酶信息见表2。PCR扩增条件：94℃变性4 min，（94℃变性30 s，60℃退火25 s，72℃延伸25 s）×34循环，72℃延伸5 min。酶切体系：内切酶0.5 μL（5 U），Buffer 1 μL，PCR 产物 2 μL，ddH2O 补齐至 10 μL。在37℃下用PCR仪孵育2 h，取6 μL酶切产物与2 μL上样缓冲液混合，用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，电压90 V进行电泳45 min。电泳结束后用EB染色，用凝胶成像系统拍照记录酶切结果。

1.4 统计分析日龄、饲料、药物及候选基因序列变异与胫色的关联性均用SAS 9.2进行卡方检验分析，显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 日龄、饲料和药物对黄羽肉鸡青胫外显率的影响如表3所示，随着日龄增长，全价料组和自配料组黄羽肉鸡的青胫比例均显著降低（P＜0.05），但药物组变化不显著（P＞0.05）。在相同日龄下，不同饲料和药物添加对青胫外显率均有显著影响（P＜0.05）；21日龄时药物组青胫比例最低，45日龄时全价料组青胫比例最低，其次是自配料组。因为全价料、药物和自配料组青胫比例在21日龄和45日龄的分布模式并不相同，因此这些结果也表明饲料、药物和日龄对黄羽肉鸡青胫外显率的影响存在明显的互作效应。

表2 BCDO2及Id位点内SNP信息

2.2 BCDO2和Id位点序列变异与青胫表型的关联性分析本研究用 PCR-RFLP检测 BCDO2_SNP、Id_SNP和B4G_SNP的基因型，获得预期大小的PCR和酶切产物，经测序验证PCR-RFLP分型结果与测序结果一致（图1）。

BCDO2_SNP和Id_SNP位点的3种基因型在各群体中的分布无显著差异；B4G_SNP的AA型在带有青胫表型的黄羽肉鸡和略阳乌鸡中以较高的频率出现，而在带有黄胫表型的尼克和罗曼鸡中并未发现（表4）。在黄羽肉鸡品种内，本研究并未检测到AA与青胫表型显著关联（P＞0.05）。

3 讨论

鸡青胫表型通常被认定为一个由单基因Id控制的质量性状[3]，但本研究在黄羽肉鸡中发现青胫表型不仅受非遗传因素影响，而且个体青胫外显程度表现出连续变异性，因此更符合数量性状遗传特点。

本研究表明，随着日龄增长，青胫的比例在全价料组和自配料组均显著降低，特别是全价料组使用了更多含有核黄素、叶黄素等天然色素的玉米性原料，青胫比例随着日龄以更大幅度在减少。本研究证明了日龄、饲料和药物等非遗传因素对青胫外显率的影响，并发现黄皮肤基因BCDO2在黄羽肉鸡群体中高频出现。这为非遗传因素参加与青胫的调控奠定分子基础，即饲料中的类胡萝卜素会因为BCDO2基因的存在而在皮肤中大量沉积，影响青胫外显率。

表3 日龄、饲料和药物对黄羽肉鸡青胫外显率的影响

表4 BCDO2、Id及B4GALT1分型结果及基因型分布情况

在试验早期，青胫比例最低的是药物组，但在试验后期药物组的青胫比例并未像饲料组那样随着日龄增长逐渐降低。氟苯尼考是当今家禽养殖中广泛使用的一种广谱类抗生素，但迄今为止它与类胡萝卜素有怎样的直接互作关系并不清楚。但氟苯尼考可能通过以下2种间接途径影响类胡萝卜素沉积，进而影响鸡的肤色：第一，预防性地使用氟苯尼考可以提高家禽抗病力，促进类胡萝卜素沉积。鸡感染球虫会抑制类胡萝卜素在皮肤中沉积，而在饲料中添加盐霉素能明显缓解这种抑制作用，提高血清类胡萝卜素水平，改善胫部着色[6]。第二，氟苯尼考可能通过影响鸡肠道微生物群系结构，影响类胡萝卜素的代谢。长期使用抗生素不仅改变鸡肠道微生物菌群结构，而且还会对免疫力产生长远影响[7]。而肠道微生物在维生素的合成代谢方面发挥着重要作用，如B族维生素主要由肠道微生物合成，供宿主利用[8]。β-类胡萝卜素作为维生素A前体，它的合成、代谢、吸收很可能受肠道微生物的影响。基于以上研究基础，本研究推测在21日龄以前，药物组个体预防性地使用氟苯尼考导致抗病力增强，类胡萝卜素沉积效率提高，因此青胫比例比饲料组低，但随着用药时间延长，雏鸡的肠道菌群结构发生明显改变，对类胡萝卜素沉积可能产生负面影响，造成药物组在试验后期的青胫比例未持续降低。

Dorshorst等[3]发现Id_SNP与鸡青胫表型显著关联。但本研究在黄羽肉鸡群体内不论是对Id_SNP，还是对候选基因B4GALT1内的B4G_SNP均未检测到这种关联性。由于青胫表型的因果突变尚未被克隆，Id_SNP只是一个与性状关联的分子标记。本研究推测，在黄羽肉鸡传代过程中，由于Id_SNP与因果突变间多次重组，这种关联性可能消失；此外非遗传因素可能对青胫表型的鉴定产生干扰，在关联分析时引起误差。尽管如此，这些结果并不能排除黄羽肉鸡青胫表型具有遗传基础的可能性。本研究认为，黄羽肉鸡的青胫表型也是由基因突变引起，之所以呈现出数量性状的特征可能与修饰基因、环境间的互作有关。如果上述推测成立，则解决黄羽肉鸡青胫问题的根本在于淘汰青胫基因。B4G_SNP的AA基因型只在带有青胫表型的品种中出现。如果A等位基因确实与青胫基因紧密连锁，在黄羽肉鸡中未检测到关联是因为非遗传因素干扰，在今后的选育工作中应该控制环境因素，分别统计AA型母鸡的后代青胫比例是否显著高于GG型。这不仅有助于澄清上述推测，而且将为B4G_SNP是否可用于黄羽肉鸡青胫表型的选淘提供重要依据。