ITGB5和MUC13基因在产肠毒素大肠杆菌抗性和易感大白仔猪间的差异表达分析

徐庆磊，Serafino M.A.Augustino，米思远，王雅春，黄锡霞，张 勤，俞 英*

（1.新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193）

仔猪腹泻常导致仔猪生长发育停滞、饲料报酬低、成活率降低，给养猪业带来了巨大损失[1]。有研究表明，产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起新生和断奶仔猪腹泻的主要致病菌，其中F4型ETEC是危害最大的致病菌之一[2]。仔猪对产肠毒素大肠杆菌F4（ETEC F4）的抗性或易感是由大肠杆菌黏附素性菌毛能否黏附到小肠上皮细胞表面的受体上决定的，其通过释放肠毒素引起水盐代谢紊乱进而导致肠腔内积液引发腹泻[3]。因此，研究控制ETEC F4的受体基因，有助于开展猪分子抗病育种工作，选育出F4型大肠杆菌腹泻抗性猪。

Fu等[4]通过全基因组关联分析筛选到可能编码ETEC F4受体蛋白的候选基因整合素β5（ITGB5）、黏蛋白13（MUC13）等。牛晓艳等[5]发现，猪ITGB5基因上3个SNP与仔猪腹泻显著相关。王文文[6]利用CRISPR/Cas9 技术敲除ITGB5基因后，发现该基因缺失显著降低黏附到小肠上皮细胞上的 ETEC数目，而过表达会增加细菌黏附数。截止到目前为止，没有关于ITGB5基因在抗性和易感猪的表达差异的报道。

本实验利用荧光定量PCR技术检测ITGB5和MUC13基因在仔猪ETEC F4抗性和易感个体间的差异表达情况以及在不同组织间的表达差异，验证ITGB5和MUC13基因作为ETEC F4候选受体基因的功能，进而为选育出ETEC F4抗性猪提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本实验所用动物为中国农科院实验动物场饲养的大白仔猪，所有仔猪饲养于相同环境。在35日龄屠宰189头大白仔猪并采集其小肠、脾脏、肺脏、胸腺、肝脏和淋巴，现场液氮保存，之后转移到-80℃冰箱储存。提取RNA所用试剂Trizol Reagent购自Ambion（美国），反转录试剂盒购自TaKaRa（大连），荧光定量试剂盒购自Roche（德国）。

1.2 黏附实验和基因分型 首先在屠宰后2 h内收集约10 cm的空肠段，沿其纵轴切开，并用低渗EDTA溶液（5 mmol/L，pH 为7.4）清洗。用显微镜载玻片刮擦空肠组织的黏膜表面，并经后续处理制备得到小肠上皮细胞。将小肠上皮细胞刷状缘细胞悬浮液和ETEC F4悬浮液（各0.1 mL）与0.4 mg/mL甘露糖混合，并在室温下孵育30 min。显微镜观察细菌黏附情况，根据黏附到小肠上皮细胞上的细菌个数将49头ETEC F4不黏附的仔猪划分为ETEC F4抗性群体，而小肠上皮细胞与ETEC F4黏附的140头仔猪划分为ETEC F4易感群体，这项工作已经由本课题组其他成员在前期完成[7]。本实验同时对前期通过全基因组关联分析（GWAS）找到的与ETEC F4黏附表型显著关联且位于ITGB5基因和MUC13基因内部的SNP进行基因分型。首先提取小肠组织基因组DNA，分别针对ITGB5基因和MUC13基因的SNP，利用Primer 6和Oligo 6软件设计引物，引物序列见表1。PCR扩增体系为25 μL：金牌Mix 22 μL，上、下游引物各 1 μL（10 nmol/μL），DNA 模板 1 μL。反应条件：95℃ 2 min；98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s，30个循环；72℃ 2 min。随机选择黏附和非黏附个体的PCR扩增产物进行Sanger双向测序并进行基因分型。综合黏附表型与基因分型的结果，最终得到抗性和易感全同胞仔猪各4头用于后续检测基因表达量。

表1 SNP分型和荧光定量引物序列

1.3 RNA提取和反转录 Trizol法提取小肠、脾脏、肺脏、胸腺、肝脏和淋巴6个组织的总RNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，使用NANODROP 2000超微量分光光度仪测定RNA浓度和纯度，-80℃冰箱保存。以总RNA为模板，按照试剂盒说明反转成cDNA。具体反应程序：① 5× gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL， 总 RNA 1 μg，RNase Free ddH2O补足体系至 10 μL，反应条件为42℃ 2 min或室温 5 min；② 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4 μL，Prime-Script RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL， ① 中反应体系 10 μL，RNase free ddH2O 4 μL，总体积 20 μL，反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.4 实时荧光定量PCR 参照NCBI数据库中ITGB5基因mRNA序列（登录号：NM_001246669.1）和MUC13基因mRNA序列（登录号：NM_001105293.1），利用Primer 6和Oligo 6软件设计荧光定量引物，并以GAPDH和β-actin作为内参基因。引物信息见表1，引物交由北京擎科生物技术有限公司合成。以小肠等6个组织的cDNA为模板，配置反应体系：Blue-SYBRGreen mix 10 μL，Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，模板 cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，总反应体积 20 μL。PCR扩增程序：95℃预变性 10 min，95℃变性 10 s，60℃退火 10 s，72℃延伸 10 s，变性到延伸45 次循环；熔解曲线形成程序：95℃ 5 s，65℃ 1 min，97℃ 10 s，40℃ 10 s。利用 2-ΔΔCt公式计算基因的相对表达量，每个样本3次重复，取平均值用于扩增效率的检测，并分析熔解曲线。

1.5 统计分析 使用SPSS 23.0软件对表达量数据进行统计和分析，结果用平均值±标准差表示，用单因素方差分析比较ITGB5和MUC13基因在6个组织中的表达量差异，用t检验分析抗性和易感个体的组间差异性。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 ETEC F4抗性与易感个体的筛选 根据黏附表型选择黏附和非黏附个体，并对于黏附表型显著关联且位于ITGB5基因和MUC13基因内部的SNP进行基因分型。如图1所示，ITGB5基因在g.135577826位点存在T/C突变位点，并且T对C为显性，即CC基因型个体对大肠杆菌 F4 菌株表现为抗性，TT基因型个体表现为易感；MUC13基因在g.135435490位点存在A/G突变位点，且A对G为显性，即GG基因型个体对大肠杆菌 F4 菌株表现为抗性，AA基因型个体表现为易感。结合黏附表型的结果，最终得到基因纯合型抗性和易感全同胞仔猪各4头。

图1 ITGB5和MUC13基因遗传变异位点测序图

2.2 ITGB5和MUC13基因在大白仔猪不同组织中的表达谱 如图2所示，ITGB5基因在不同组织中均有所表达，其中在肺脏中高度表达，并显著高于小肠、淋巴、胸腺和肝脏（P＜0.05），在脾脏中表达量较高，显著高于小肠和淋巴（P＜0.05），而在小肠、淋巴、胸腺和肝脏中表达量较低；MUC13基因在小肠中高度表达，其表达量显著高于脾脏、淋巴、胸腺、肝脏和肺脏（P＜0.05）。

图2 ITGB5（A）和MUC13（B）基因在不同组织中的相对表达量

2.3 ITGB5和MUC13基因在ETEC F4抗性和易感大白仔猪的表达差异分析 针对ITGB5基因（图3-A），在ETEC F4抗性个体的小肠组织中的表达量低于易感个体（P＞0.05）；ETEC F4抗性个体的肺脏组织中的表达量显著低于易感个体（P＜0.05）。对于MUC13基因（图3-B），其在ETEC F4抗性个体小肠组织和胸腺中的表达量均显著高于易感个体（P＜0.05），而在其他组织中抗性和易感个体未见显著性差异（P＞0.05）。

图3 ITGB5和MUC13基因在大白猪F4大肠杆菌抗性与易感型个体间的表达差异

2.4 候选基因相关分析及免疫相关基因在仔猪小肠组织中的表达差异分析 由图4可见，IL-6基因在抗性个体中的表达量低于易感个体，其余免疫相关基因IL-8、TNF-α、NF-κB在抗性个体中的表达量均高于易感个体，但均未达到统计学差异（P＞0.05）。

图4 免疫相关基因在抗性和易感大白仔猪的表达量差异分析

3 讨 论

3.1 仔猪腹泻抗性相关基因ITGB5和MUC13的组织表达差异 本研究检测ITGB5和MUC13基因的组织表达情况发现，ITGB5在不同组织中均有不同程度表达，其中在肺脏中高度表达，在脾脏组织中度表达，而在小肠、淋巴、胸腺和肝脏中表达量较低。整合素αvβ3与ITGB5基因编码的整合素αvβ5同属于整合素家族，整合素αvβ3广泛表达于内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞等[8]，而肺脏中含有微血管内皮细胞以及脾脏中含有大量的巨噬细胞，这也可能是ITGB5基因在肺脏和脾脏中表达量较高的原因。MUC13基因在小肠中高度表达，在脾脏、淋巴、胸腺、肝脏和肺脏中表达量较低或几乎不表达。钦伟云等[9]研究发现，MUC13基因在梅山断奶仔猪的十二指肠和空肠中高度表达，这与本研究结果一致。上皮细胞表面分泌的黏蛋白在抵抗肠道致病菌感染中起重要作用，因此MUC13基因在小肠中高度表达，其编码的黏蛋白可能与致病性大肠杆菌发生互作，阻止致病菌结合糖蛋白分子，从而降低了黏附到小肠上皮细胞的细菌数，提高了机体的抵抗力。

3.2 ITGB5和MUC13基因在腹泻抗性和易感大白仔猪间的表达差异分析 本实验检测发现，ITGB5基因在抗性个体小肠中的表达量低于易感个体，这说明ITGB5基因的低表达水平可能有助于防御F4型ETEC对仔猪小肠上皮细胞的侵袭，该基因在仔猪腹泻抗性调控过程中发挥重要作用。本研究还发现，MUC13基因在抗性个体小肠中的表达量显著高于易感个体。针对MUC13基因在抗性和易感个体中的表达量差异，前人的研究结果不一。Schroyen等[10]研究发现，MUC13基因在抗性个体中的表达量显著高于易感个体，与本研究结果一致。而杨怀谷[11]研究发现，在苏太猪与杜×长×大三元杂交商品猪中，MUC13基因在不同黏附表型个体中的表达无显著性差异；Sinha等[12]研究印度本地猪种不同黏附表型个体的MUC13基因在空肠表达的差异性时发现，MUC13基因在黏附猪个体和不黏附个体的表达量未达到显著性差异。这可能是由于猪种不同导致实验结果不一致。

针对MUC13基因分型结果，本研究发现表现为抗性个体的GG型为野生型，表现为易感个体的AA型为突变型，而针对ITGB5的基因分型与之相反。结果提示，突变型个体小肠中MUC13基因的低水平表达，可能导致其编码的小肠上皮细胞表面的黏蛋白不能有效阻止致病性大肠杆菌结合糖蛋白分子，进而使黏附到小肠上皮细胞的细菌数增加，仔猪表现为对致病性大肠杆菌易感。在抗性个体和易感个体中ITGB5基因的表达量尽管没有显著性差异，但ITGB5基因在抗性个体的表达量明显高于易感个体，而MUC13基因内部的SNP位点可能是调节突变，但它们是否为ETEC F4 受体基因真正的因果突变还需进一步确定。

3.3 ITGB5和MUC13基因与仔猪腹泻的关系 课题组前期通过GWAS发现，ITGB5和MUC13基因是仔猪腹泻抗性的重要候选基因[4]。ITGB5基因编码整联蛋白的β亚基，整联蛋白是参与细胞黏附的细胞表面受体，通过细胞表面介导细菌黏附的玻连蛋白，使整联蛋白与致病菌黏附[13]。MUC13基因编码的黏蛋白是由导管和腺上皮组织表达的分泌于细胞表面糖蛋白家族成员。有研究表明，MUC13基因编码的蛋白对黏膜上皮具有保护和润滑的作用，可以降低细胞与细胞及细胞外基质的黏附[14-16]。ETEC F4黏附到ITGB5或MUC13基因可能编码的受体蛋白上，感染小肠上皮细胞，往往能激活免疫反应，导致免疫相关基因的表达量发生变化。本研究发现在抗性和易感个体中免疫相关基因IL-6、IL-8、TNF-α、NF-KB均未见显著性差异。Zhou等[17]研究发现，与未攻菌组相比，ETECs 感染后会引起猪小肠上皮细胞系IPEC-J2 细胞中免疫相关基因显著上调。Devriendt等[18]同样发现，ETEC F4感染 IPEC-J2 细胞均显著增加IL-6 和IL-8 的表达。上述研究结果与本研究结果不一致，可能的原因是，在本试验中根据黏附试验得到黏附抗性和易感个体并检测其免疫基因的表达量，与他人实验设计方法不同，即实验组对IPEC-J2 细胞系进行ETEC攻菌，对照组进行PBS处理不同，导致研究结果有区别。

基于本研究以及已报道的2个候选基因的功能，本研究提出候选基因对F4型ETEC的抗性调控假说。如图5所示，致病性大肠杆菌通过玻连蛋白（Vn）的桥梁作用间接黏附到ITGB5基因编码的整合素V5受体蛋白，引起“触发”机制使致病菌定植到小肠上皮细胞并释放肠毒素，激活腺苷酸环化酶系统，使细胞内环磷酸腺苷（cAMP）大量分泌，大量氯离子和水分子持续转运入肠腔引发腹泻；另一方面MUC13基因编码的黏蛋白具有保护和润滑肠道黏膜上皮并阻止或减少病原菌侵染的作用。因此，ITGB5和MUC13基因可能在抵御ETEC F4感染时均发挥作用，是ETEC F4引起仔猪腹泻重要的抗性候选基因。

图5 ETEC侵染仔猪小肠上皮细胞假说

4 结 论

本研究发现，ITGB5基因的低水平表达可能有助于抵抗F4型ETEC对仔猪小肠上皮细胞的侵袭；MUC13基因在小肠中高度表达，且在抗性个体中的表达量显著高于易感个体，表明MUC13基因的高表达可能有助于降低致病菌黏附到小肠上皮细胞上，进而实现对致病性大肠杆菌的抗性。本实验进一步验证了仔猪腹泻抗性候选基因ITGB5和MUC13的功能，这为仔猪抗腹泻的育种工作提供了技术依据。