肠道病毒D68型和C96型的研究进展

刘阳阳，刘洪波

(桂林医学院第二附属医院检验科，广西 桂林 541100)

肠道病毒(enterovirus，EV)隶属于小核糖核酸病毒目、小RNA病毒科。在国际病毒分类委员会发表的最新病毒分类第十次报告中，将其分为EV A～J 9组，其中A～D组为人类EV[1]。1999年，Oberste等[2]首次提出了分子生物学定型人类EV血清学的方法。随着生物学信息的不断补充、完善及分子生物学分型方法的不断改进，新的EV血清型不断被鉴定出来，现已编码至EV123[1]。EV引起的感染多为无症状隐性感染，但仍可进一步导致多种急、慢性疾病的发生，常见的有急性弛缓性麻痹、急性无力脊髓炎、急性出血性结膜炎、无菌性脑膜炎、心肌炎、手足口病及新生儿全身性感染等，严重者甚至可危及生命[3]。目前，在我国已报道的EV检出型别有EV71、EVD68、EV73、EV75、EV90、EV96、EV97[4-5]及EV118[6]等，但除EV71、CA16外其他型别多为偶有检出，并因尚未引起疫情而未受到广泛重视。随着相关病例的不断涌现，新EV(EVD69、EVC96)正逐渐引起大家的重视。现就EVD68及EVC96的生物学特征、分子流行病学、致病性及治疗等方面的研究进展予以综述。

1 流行病学

1.1流行地区 EVD68于1962年首次从美国加利福尼亚州伯克利市4例急性呼吸道感染及肺炎患儿的样本中分离[7]。之后很长一段时间关于EVD68感染的报道极少，直到2014年夏季在美国和加拿大多个地区出现了儿童因EVD68感染导致急性呼吸道疾病的大规模暴发[8]，自此以后EVD68才引起了全球的广泛关注，并陆续在多个地区出现过暴发。目前，EVD68在我国北京、上海、重庆等多个地区均有检出。

EVC96自2000年首次分离于孟加拉国一例急性弛缓性麻痹患者的粪便标本后，陆续在亚欧大陆许多国家(哥伦比亚、斯洛伐克、芬兰、玻利维亚、菲律宾及中国等)的急性弛缓性麻痹患者或健康人群甚至环境标本中均有发现[9]。根据相关报道及美国国立生物技术信息中心中的毒株信息发现，其在我国流传较广，在云南、广东、山东、新疆、河南等多地均有检出[10-13]。目前，在全球范围内未曾出现EVC96的相关疫情报道，但其在我国的检出率逐年升高。

1.2流行时间与易感人群 EVD68常于早秋至冬季流行[13]，根据地区不同可稍有差异[14]。其可感染各个年龄段人群，但以成人为主。荷兰的一项调查显示，EVD68在50～59岁年龄组检出的阳性率最高[12]，性别分布则较一致[3]，但在儿童和青年的感染中更易出现神经系统症状。

EVC96具有典型的EV流行特点，主要在夏季至早秋流行，以婴幼儿为主要感染对象，其中又以学龄前儿童最为多见，考虑与学龄前儿童的良好卫生习惯尚未养成及免疫力较低有关，其在成人中的感染多为自限性的隐性感染，尚无相关重症病例报道。

1.3分子流行病学 EV的流行方式主要有常见血清型的持续流行和特定的血清型集中暴发两种，后者是疾病出现暴发流行的重要原因之一；作为RNA病毒的一种，其具有变异率高的特点，主要进化方式有基因重组和基因突变。在人体免疫或药物压力作用下，病毒不断地进化从而导致新的血清型出现。病毒的基因重组又包括型间重组和型内重组，有研究表明EV型内重组的发生率远高于型间重组[15]。同时随着病毒流行时间越久，传播距离越远，其发生重组和突变的概率也随之增加，故致使现今流行毒株与原型株有了较大差异。

目前，EVD68流行的主要有4个血清型及数个分支，包括原型株Fermon[7]及A、B、C 3个基因型[16]。其中，A型和B型包含了近年世界范围内流行的大多数毒株，C型目前流行程度较小；同时在一次暴发中，常出现多个基因型的共同流行。2014年，美国暴发的EVD68毒株以A1、B1、B4及B5亚型为主，加拿大流行的主要毒株为A2亚型；且在欧洲国家(意大利、荷兰等)也发现了A1、A2、B1和B2亚型感染的病例[17-21]。在亚洲国家(泰国、日本等)发现有B型及C型共同流行的现象，中国则以A2亚型和B2亚型为主[22]。且在2011年以前，在中国的EVD68感染病例中A2亚型占主导地位，但在2014年的调查中则以B2亚型为主导，2011—2014年两者均有发现[22]。Xiang等[23]认为，不同亚型同时流行或交替流行的现象提示在此期间发生了EVD68的基因重组。同时，他们通过进行序列分析发现在发生基因重组的同时，EVD68的基因突变现象也在各型别间十分常见，尤其是近年检测到的序列发生了很大变异。Laine等[24]发现，除了在5′非编码区有一或两段碱基的缺失外，部分序列在VP1区也出现3个碱基缺失的现象，这可能是造成相关疾病暴发流行的原因之一。此外，在我国检测到的毒株基因序列也存在氨基酸缺失的现象[16]，但目前尚未出现暴发性流行。Xiang等[23]的研究显示，在我国成人群体中EVD68的血清中和抗体较高，可能是尚未出现暴发的原因之一。但由于EV的重组速度极快，故其仍有在我国大规模暴发的风险，应保持警惕。

通过对EVC96的基因序列进行分析发现，其在非结构蛋白区有广泛的重组现象发生[18]。但因EVC96出现较晚、分离数量较少，故目前对其研究仍较少。EVC96发生基因重组的概率极高，胡岚[15]研究发现，包括新疆、河南、安徽、湖北、西藏等多个地区的中国分离株均存在型间重组，且各毒株重组情况各异，十分复杂，其中3株新疆分离株之间存在型内重组的现象，Xu等[25]的研究也得出一致结论。Smura等[26]对芬兰分离株的研究也进一步证实了EVC96发生基因重组的普遍性。同时，胡岚[15]还对12株中国分离EVC96毒株的VP1序列进行了分析，将其分为A～G共7个基因型，每一株或两株分离株就代表了一种基因型，这与汤晶晶等[27]的研究结果一致。可见，在我国传播的EVC96变异十分大。除出现重组外，一些EVC96毒株还存在部分序列在VP1区出现3个碱基缺失的现象，但对其致病性的影响暂不明确。EVC96在我国多个省份流行的毒株各异，亲缘关系远近不一[15,27]。虽然目前尚未出现大规模暴发，但其变异速度快、检出率日渐升高，故亟待进一步研究。

2 感染机制及致病性

2.1感染机制 EVD68以呼吸道传播为主。其最适生长温度为33 ℃，而非EV常见的37 ℃，并对酸和热不稳定，这些生物学特征与人类鼻病毒极为相似，在发现初始甚至被认为是人类鼻病毒的一种，被命名为人类鼻病毒87型，后利用分子生物学手段进行分析后才被重新命名为EVD68，这种生物学特性也决定了其更容易入侵呼吸道并通过呼吸道分泌物传播的致病特点。Uncapher等[28]研究发现，神经氨酸酶能通过催化唾液酸水解使EVD68对海拉细胞的黏附减少，表明唾液酸可能是其潜在的受体。随后Liu等[29]的研究进一步证实了细胞表面的唾液酸是EVD68的特异性受体，而人体呼吸道上皮细胞表面存在的唾液酸为EDV68在呼吸道进行复制增殖创造了条件。Imamura等[30]发现，EVD68对主要存在于上呼吸道的α2～6链唾液酸的亲和力大于α2～3链唾液酸，这可能是EVD68更易造成上呼吸道感染的原因。同时与下呼吸道相比，上呼吸道的pH值较高而温度较低，更加适宜EVD68复制，这可能也是其以上呼吸道感染为主的原因之一[30]。但某些EVD68毒株不仅可通过唾液酸受体感染细胞，也可感染表面缺乏唾液酸的细胞，如2014年在美国暴发流行时检出的US/MO/14-18947及US/KY/14-18953毒株，研究发现其感染对唾液酸的依赖性低，神经氨酸酶处理不能有效影响病毒复制，说明EVD68可能存在其他介导感染的受体[31]。2016年，在Wei等[31]发现了EVD68的首个蛋白受体神经元特异表达的细胞间黏附分子5(intercelluar adhesion molecule-5，ICAM-5)，其可与EVD68特异性结合，敲除ICAM-5或加入ICAM-5-Fc重组蛋白竞争性结合病毒后，EVD68的感染和复制均明显受到抑制；在不能被EVD68感染的非洲绿猴肾细胞中外源表达ICAM-5后，病毒的复制及感染能力显著增强，同时ICAM-5还可增强上述两株非唾液酸受体依赖的EVD68毒株的病毒感染性，说明该受体能够介导进化变异过程中唾液酸依赖和非唾液酸依赖的EVD68毒株对宿主的感染，同时ICAM-5-Fc重组蛋白能有效阻断EVD68的入侵与复制。

除上述EVD68侵入呼吸道的机制外，目前对EV的感染机制研究比较有限。包括EVC96在内的多数EV传播方式均为粪-口传播，一般认为病毒最先侵及呼吸道或消化道黏膜组织，其在肠黏膜中进行的复制可持续数周，在此过程中子代病毒可随粪便排出体外，感染初期病毒还可进入血液循环出现毒血症。当病毒到达次级靶器官之后对其进行攻击，从而产生相应的临床症状，这也是多数EV的致病机制。但随着病毒的不断进化，新的血清型不断出现，各自不同的生物学性状、基因结构均不同程度地影响了病毒致病机制的改变。因此，尽快探明病毒感染机制，从而阻断其在人群中的传播，是目前EV防治工作中迫切需要解决的问题之一。

2.2致病性 EVD68与其他EV感染的不同之处在于其以呼吸道感染为主，可引起患者出现咳嗽、流涕、发热、呼吸困难等典型上呼吸道感染症状，甚至可出现因呼吸困难、血氧不足需要住院治疗的情况，同时也可表现出显著的发热、肌痛、咳嗽、腹泻等典型EV感染症状，此外EVD68还可引起无支气管痉挛和有哮喘病史感染者的再次发病[11]。有研究表明，EVD68的感染与哮喘发病率有密切联系[32]。且EVD68可导致中枢神经系统疾病急性弛缓性麻痹、急性无力脊髓炎的发生[33]。已证实，EVD68可引起脊髓灰质中前角细胞的损伤[34]。其在神经系统的致病机制与EV71十分相似，在Messacar等[35]的研究中，12例EVD68感染的患儿均出现不同程度的神经系统症状。Kreuter等[10]在1例脑膜炎患儿脑脊液中检出EVD68，并确认EVD68感染为致死疾病病因，提示EVD68可能具有嗜神经性。但与同样具有嗜神经性的EV71不同，EVD68感染累及神经系统的表现主要出现在手臂及脑神经，而脑干是EV71感染的最易受累部位。Hixon等[36]设计了一系列小鼠模型实验证实，EBD68部分毒株也存在神经系统的致病性。且Wei等[31]发现的神经元特异表达的ICAM-5是EVD68的特异性受体，也证实了这一点。此外，EVD68还可与其他呼吸道病毒共同感染，进一步加重感染[37]。

目前，我国的EVC96毒株多分离于手足口病、急性弛缓性麻痹、急性无力脊髓炎患儿标本。Xu等[25]的研究认为，EV96-SZ/GD/CHN/2014分离株可单独导致手足口病的发生，但除此之外尚无EVC96与其他疾病有确切关系的证据。

3 诊断、治疗及预防

3.1临床诊断 目前，临床对于肠道感染的初步诊断仍依靠医师的经验性诊断。实验室诊断主要包括病毒分离、血清学方法和分子生物学方法，其中病毒分离是经典的方法，但由于进行分离培养的周期过长故难以做到早期诊断，易导致病情延误甚至误诊。血清学方法可鉴定的型别有限，同时各型别之间的交叉反应可能造成结果的假阳性。分子生物学手段(逆转录聚合酶链反应和下一代测序技术等)正不断发展，但因对设备、人员要求较高，故距离大规模应用于临床诊断尚有一段距离；而以VP1为目标片段研制的探针，有望成为高效的特异性检测手段。但目前临床针对EVC96及EVD68尚无特异性诊断方法。

3.2治疗与预防 EV感染治疗目前仍以广谱抗病毒治疗为主。对于EVD68引起的呼吸道严重感染除尽早改用抗病毒治疗外，还应在需要时使用呼吸机机械通气或插管辅助呼吸，而对EVD68引起的严重神经系统病变(急性无力脊髓炎)，美国疾控中心至今仍无推荐用药。Hixon等[36]研究认为，氟西汀对运动障碍或病毒负荷没有影响，而地塞米松治疗甚至可以加重损伤、提高死亡率、增加病毒载量。目前，以人类EV的小RNA病毒非结构蛋白区为靶点的抗病毒药物正在研发中，但其具体药物作用机制尚未明确。且其他EV抑制剂也在研发中，如Pleconaril。Hernández[38]进行的双盲试验发现，其治疗组的病毒培养转阴性快于安慰剂组，死亡率低于安慰剂组，故有望成为EV的有效治疗手段，但目前在我国尚未批准上市。

疫苗接种是EV感染的最佳防控手段，目前我国仅有3种EV71型疫苗批准上市，其他血清型的疫苗暂时仍处空白或研发阶段。且对EVC96的VP1表位疫苗的研发正在进行中，EVD68则尚无相关报道。

4 小 结

EV呈全球化流行，且变异极快，在不断重组、进化中新血清型不断增加，虽以隐性感染为主，但多个型别曾在全球多个地区暴发疫情。目前，除EV71、CA16等致病性明确、流行时间长的重要病原体已得到广泛重视外，许多散发病原体并未得到重视，但这些病原体造成大规模暴发的潜能却不容忽视，如EVD68感染已在欧美多个地区出现过疫情。因此，进一步建立完善的EV监测系统、不断改进分型方法，同时不断探究人类EV的致病性及其传播、循环和进化模式并加快对抗病毒药物和疫苗的研发均是EV感染防控工作中迫切需要解决的问题。